Pharmazeutische Zeitung online
Platanenborke

Ein neues Dermopharmazeutikum?

28.02.2011  13:41 Uhr

Von Ana Paula Simões-Wüst1, Peter Lorenz2, Ina Albert3, Vera Luginbühl3, Florian Stintzing2, Lukas Rist1, Ulrich Meyer2 / Seit einigen Jahren werden betulinreiche Birkenrindenextrakte in emulgatorfreien Zubereitungen dermopharmazeutisch genutzt. Da Platanenborke hohe Konzentrationen der nahe verwandten Betulinsäure enthält, lag es nahe, die Eigenschaften von Cortex-Zubereitungen dieses Baumes zu untersuchen. Der vorliegende Beitrag stellt In-vitro-Untersuchungen von Platanenextrakten vor. Die Wirkung der Extrakte im Vergleich zu reinem Betulin und Betulinsäure wird an zwei Hautzell-Modellen demonstriert.

1) Paracelsus-Spital Richterswil, Richterswil, Schweiz; 2) Wala Heilmittel GmbH, Bad Boll/Eckwälden, Deutschland; 3) Zürcher Hochschule für Angewandte Wissenschaften (ZHAW), Wädenswil, Schweiz

In der Fachliteratur der vergangenen Jahre finden sich immer wieder Untersuchungen zur dermatologischen Wirkung von Birkenextrakten und dem darin enthaltenen Betulin (Laszczyk, Jäger et al. 2006; Jäger, Laszczyk et al. 2008). Betulin zählt zur Klasse der Triterpenoide und zeigt vielfältige biologische Wirkungen (Dzubak, Hajduch et al. 2006; Hänsel und Sticher 2007; Weck­esser, Laszczyk et al. 2010). Eine dem Betulin strukturanaloge Verbindung ist die Betulinsäure. Während Betulin am C17 (Abbildung 2, R) mit einer Hydroxymethylgruppe substituiert ist, trägt Betulinsäure an der entsprechenden Position eine Carboxylgruppe.

PZ-Originalia

In der Rubrik Originalia werden wissen­schaftliche Untersuchungen und Studien veröffentlicht. Eingereichte Beiträge sollten in der Regel den Umfang von zwei Druckseiten nicht überschreiten und per E-Mail geschickt werden. Die PZ behält sich vor, eingereichte Manuskripte abzulehnen. Die veröffentlichten Beiträge geben nicht grundsätzlich die Meinung der Redaktion wieder.

Die Betulinsäure findet sich in hoher Konzentration in der Borke der Platane (Platanus x acerifolia [Aiton] Willd.), aus der sowohl die reine Verbindung, als auch hochangereicherte Extrakte gewonnen werden können. Der Einsatz der Borke bietet sich um so mehr an, als die Platane diese bekanntlich jedes Jahr abwirft (Abbildung 1) und ein Schälen oder Fällen des Baumes folglich unnötig ist. Große Mengen können so einfach durch Sammeln gewonnen werden – unter dem Aspekt der Nachhaltigkeit ein geradezu idealer Rohstoff.

Da organische Lösungsmittel wie beispielsweise Heptan aufgrund möglicher Rückstände im resultierenden Extrakt zu vermeiden waren, wurden zunächst Borken-Extrakte mit verschiedenen Alkoholen (unter anderem Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol) hergestellt, die – wie nachfolgende Analysen belegten – hinsichtlich ihres Betulinsäuregehaltes deutlich variierten.

 

Überraschenderweise zeigte sich, dass mit den so gewonnenen Platanen-Extrakten emulgatorfreie, langjährig stabile Cremes hergestellt werden können, obwohl sich reine Betulinsäure – ähnlich wie Betulin – sowohl in hydro- wie auch lipophilen Medien extrem schlecht löst. Daher ist zu vermuten, dass weitere im Gesamt-Extrakt enthaltene Substanzen wie beispielsweise Platanensäure solubilisierend wirken. Für die Entdeckung gewährte das Deutsche Patentamt Schutzrechte [Patent-Nr. DE 10 2006 038 471 A1, (Meyer 2006)], weitere Patentanmeldungen erfolgten weltweit.

 

Im nächsten Schritt wurde die In-vitro-Wirkung von zwei Platanenborken-Extrakten im Vergleich zu reinem Betulin und reiner Betulinsäure untersucht. Methodisch folgte die Untersuchung weitgehend der Arbeit von Laszczyk und Mitarbeitern (Laszczyk, Jäger et al. 2006), die erstmals Daten zu Birkenrindenextrakten vorstellte.

 

Untersuchungsmethode

 

Zur Testung der zytotoxischen Eigenschaften wurden zwei Platanenborken-Extrakte mit unterschiedlichem Betulinsäuregehalten herangezogen. Die gaschromatografische Analyse ergab im Platanenextrakt A 39 Prozent und im Platanenextrakt B 66 Prozent Betulinsäure. Beide Extrakte wiesen eine vergleichbare, geringe Konzentrationen an Betulin auf (Extrakt A: 0,6 Prozent; Extrakt B: 0,7 Prozent).

Die biologische Aktivität beider Extrakte – wie auch der Reinsubstanzen Betulin und Betulinsäure – wurde an zwei verschiedenen humanen Hautzelllinien getestet, der spontan immortalisierten, nicht malignen Keratinozyten-Zelllinie HaCat und der Epidermoidkarzinom-Zelllinie A 431. Aufgrund der hydrophoben Eigenschaften der Testsubstanzen diente DMSO als Lösungsmittel. Je nach Methode wurden die Zellen 24 bis 28 Stunden mit den Testsubstanzen inkubiert und anschließend dem jeweiligen Zytotoxizitäts-Test unterzogen. Die Ergebnisse resultieren aus Vierfachbestimmungen und sind als Mittelwerte ± Standardabweichung angegeben.

 

Zytotoxisch für humane Hautzellen

 

Um zu prüfen, inwieweit die Platanenextrakte auf Hautzellen zytotoxisch wirken, wurde zunächst die Freisetzung von Lactatdehydrogenase (LDH) in das Zellkulturmedium erfasst. Unter physiologischen Bedingungen befindet sich dieses Enzym im Zellinneren. Bei Schädigung der Zellmembran durch zytotoxisch wirkende Substanzen wird LDH ins umgebende Zellkulturmedium freigesetzt. Je höher der Grad der Zellschädigung ist, desto größer ist die Menge an freigesetztem LDH im Überstand (Medium). In diesem kann dann die enzymatische Aktivität von LDH anhand der Reduktion eines gelben Tetrazoliumsalzes zu einem roten Formazan photometrisch bestimmt werden. Diese Menge an LDH korreliert mit der Menge an gebildetem Formazan und ist daher direkt proportional zur Anzahl geschädigter Zellen.

 

Bei der Keratinozyten-Zelllinie HaCat führten beide Platanenextrakte zu einer deutlichen, konzentrationsabhängigen Freisetzung von LDH (Abbildung 3). Während im Falle des Extrakt B bereits bei 5 μg/ml ein zytotoxischer Effekt gemessen wurde, war dies bei Extrakt A erst bei 10 μg/ml der Fall. Wie erwartet, resultierte eine Inkubation mit den Reinsubstanzen Betulinsäure (10 und 40 μg/ml) und Betulin (5, 10 und 40 μg/ml) ebenso in einer konzentrationsabhängigen LDH-Freisetzung. Im Vergleich dazu zeigte sich die Epidermoidkarzinom-Zelllinie A-431 weniger sensitiv gegenüber der Exposition mit Platanenextrakten, Betulin und Betulinsäure (Abbildung 3).

Einschränkend ist zu erwähnen, dass Zellen auch so geschädigt werden können, dass sie noch eine intakte Zellmembran aufweisen und kein LDH ins Medium entlassen. Daher kann im LDH-Test das Ausmaß geschädigter Zellen unterschätzt werden. Darüber hinaus erlaubt die Methode keine Differenzierung zwischen Nekrose (Zelltod infolge Membranstrukturschädigung) und Apoptose (programmierter Zelltod). Weiterhin ist die Freisetzung von LDH auch von der Zellzahl abhängig, das heißt bei einer Wachstumshemmung und einer gleichzeitigen Schädigung der Zellmembran wird weniger LDH ins Zellkulturmedium freigesetzt.

 

Zur Differenzierung von apoptotischen und nekrotischen Zellen sowie zur Erfassung des Einflusses der Testsubstanzen auf die Zellproliferation wurden zusätzliche Untersuchungsmethoden angewandt: Der MTT-Test beruht auf der durch mitochondriale Dehydrogenasen vitaler Zellen katalysierten Reduktion eines gelben Tetrazolium-Salzes zu einem blau- violetten Formazan, das sich wiederum photometrisch quantifizieren lässt. Die Enzymaktivität der mitochondrialen Dehydrogenasen nimmt proportional zur Anzahl stoffwechselaktiver, das heißt intakter Zellen zu. Im Gegensatz zum LDH-Test, der eine Schädigung der Zellmembran erfasst, zeigt die MTT-Methode zytotoxische Effekte bereits auf Stoffwechsel-Ebene.

 

In Abbildung 4 sind die Ergebnisse des MTT-Tests dargestellt. Die beiden Reinsubs­tanzen Betulin und Betulinsäure hemmten das Zellwachstum deutlich stärker als die Extrakte. Hierbei fielen Unterschiede in der Sensitivität beider Zellinien auf. Zell­linie HaCat reagierte empfindlicher auf Extrakt B im Vergleich zu Extrakt A. Die IC50 (Konzentration, die zu einer 50-prozentigen Reduktion der Zellvitalität führt) beider Extrakte rangierte zwischen 0,31 und 0,63 μg/ml.

Die Platane

Die Platane (Platanus x acerifolia [Aiton] Willd.) ist ein sommergrüner Laubbaum, der Wuchshöhen von 25 bis 50 Meter erreicht. Platanen sind leicht an ihren ahornähnlichen Laubblättern und kugeligen Früchten beziehungsweise behaarten Nüsschen erkennbar. Ihre Borke blättert jährlich in dünnen Platten ab und hinterlässt ein typisches Mosaik aus graubraunen und weißlichen Bereichen. Aufgrund ihrer hohen Widerstandsfähigkeit werden Platanen häufig in urbanen Gegenden wie Parks und Alleen gepflanzt. Naturstoffchemische Untersuchungen zeigen, dass Platanenborke bis zu 2,4 Prozent Betulinsäure enthält.

Aufgrund bekannter Differenzen zwischen dem LDH- und dem sensitiveren MTT-Test, wurden mit Letzterem deutlich niedrigere Wirkkonzentrationen gemessen. Bei einer Substanzkonzentration bis zu 0,5 µg/ml wurde keine LDH-Freisetzung beobachtet (Abbildung 3). Im Gegensatz hierzu lagen beim MTT-Test alle IC50-Werte unter 0,63 µg/ml (Abbildung 4). Durch Bestimmung der Zellzahl mit einem »viability cell counter«-System ließ sich darüber hinaus zeigen, dass trotz der beobachteten zellphysiologischen Wirkung, bei diesen niedrigen Substanzkonzentrationen keine Veränderungen der Zelldichte und Morphologie auftraten.

Es ist bekannt, dass Betulinsäure, insbesondere auf mitochondrialer Ebene, wo Dehydrogenasen wie NADPH und Cytochrom P450 lokalisiert sind, pro-apoptotisch wirkt (Fulda and Kroemer 2009). Dies erklärt den quantitativen Unterschied der Resultate aus dem LDH- und MTT-Test. Die nur im MTT-Test wirksamen, niedrigen Konzentrationen der Testsubstanzen haben vermutlich noch nicht zu einer Öffnung der Permeabilität-Transition-Poren der äußeren mitochondrialen Membranen geführt. Erst dieser irreversible Schritt leitet die Apoptose ein und lässt sich mittels LDH-Test erfassen (Schmidt, Kuzmanoff et al. 1997; Dewson and Kluck 2009). Zusammengefasst weisen die aktuellen Untersuchungen darauf hin, dass ähnlich wie Betulin und Betulinsäure auch Platanenextrakte zytotoxisch auf humane Hautzellen wirken. Physiologisch relevante Effekte sind ab 5 bis 10 µg/ml zu beobachten. Auch Laszczyk et al. konnten in diesen Konzentrationsbereich zytotoxische Effekte mit Birkenextrakten, Betulin und Betulinsäure beobachten (Laszczyk, Jäger et al. 2006).

 

Apoptose und Zellproliferationshemmmung

 

Da zytotoxisch wirkende Substanzen, da­runter die Betulinsäure (Fulda 2009; Fulda 2010), sowohl apoptotische Prozesse in Gang setzen als auch die Zellproliferation beziehungsweise Zellteilung hemmen können, wurde die Potenz der Platanenextrakte A und B diesbezüglich geprüft. Die Induktion der Apoptose wurde mittels Nachweis von Nukleosomen (Chromatin-Fragmenten) gemessen. Chromatin befindet sich in gesunden Zellen im Zellkern. Nach Induktion der Apoptose treten jedoch Nukleosomen im Zellzytoplasma auf, die histochemisch nachgewiesen werden können.

Für beide Zelllinien konnte gezeigt werden, dass der Extrakt B die Freisetzung von Nukleosomen im Zellzytoplasma anregt, das heißt Apoptose induziert (Abbildung 5). Dieser Effekt trat bereits bei einer Konzentration von 4 µg/mL auf. Hingegen induzierte der Extrakt A selbst bei einer Konzentration von 10 µg/ml die Apoptose nicht (Abbildung 5). Interessanterweise löste der Platanenextrakt B bei den HaCat-Zellen gleichermaßen Apoptose aus wie die Reinsubstanz Betulinsäure, obwohl dieser Extrakt nur einen Gehalt von 66 Prozent Betulinsäure aufweist.

 

Zum Nachweis möglicher Effekte auf die Zellproliferation diente ein weiterer kolorimetrischer Test, der auf der Inkor­poration des Thymidin-Analogons BrdU (5-Brom-2-deoxyuridin) während der DNA-Replikation beruht. Wie aus Abbildung 6 hervorgeht, hemmten die verschiedenen Testsubstanzen (10 µg/ml) die Prolifera­tion beider Zelllinien signifikant. Der Extrakt B führte bei beiden Zelllinien zu einer weitaus stärkeren Hemmung der Proliferation im Vergleich zu Extrakt A, dessen Wirkung mit Betulinsäure vergleichbar war. Während Extrakt B (10 µg/ml) bei der Zelllinie HaCat die Proliferation auf 9 Prozent und bei der Zelllinie A431 auf 23 Prozent der Kontrolle herabsetzte, hemmte die Behandlung mit Extrakt A (gleiche Konzentration) die Proliferation in beiden Zelllinien nur um circa 60 Prozent (Abbildung 6).

 

Schlussfolgerungen und Ausblick

 

Die hier vorgestellten Daten zeigen, dass Extrakte der Platanenborke sowohl auf die stark proliferierenden, nicht malignen Keratinozyten (HaCat) als auch auf die malignen Epidermoidkarzinomzellen (A-431) zytotoxisch wirken. Darüber hinaus führte die Exposition mit zwei in der Zusammensetzung differierenden Extrakten zu einer Proliferationshemmung bei beiden Zelllinien. Sowohl die zytotoxischen wie auch die proliferationshemmenden Wirkungen von Platanenextrakt B fielen im Vergleich zu Extrakt A stärker aus. Die Überlegenheit des Platanenextraktes B zeigte sich zusätzlich dadurch, dass nur dieser Extrakt apoptotische Prozesse induzierte. Im Allgemeinen waren die beobachteten Effekte auf die HaCat-Zellen im Vergleich zu den A-431-Zellen ausgeprägter. Die hierfür erforderlichen Extraktkonzentrationen lagen zwischen 5 und 10 µg/ml. Eine Ausnahme verzeichnete der MTT-Test mit wirksamen Konzentrationen unterhalb von 0,6 µg/ml.

Da ausschließlich der Extrakt B Apoptose induzierte, kann man davon ausgehen, dass der Extraktionsmethode eine zentrale Bedeutung zukommt. Der daraus resultierende höhere Gehalt an Betulinsäure im Extrakt B dürfte hierbei wesentlich sein. Während der pro-apoptische Effekt von Extrakt B und reiner Betulinsäure vergleichbar ist, zeigt der Extrakt eine deutlich ausgeprägtere Zellproliferationshemmung, sodass die Annahme nahe liegt, dass zusätzliche Extrakt-Komponenten eine synergistische Wirkung beziehungsweise bessere Verfügbarkeit der Betulinsäure bewirken.

 

Ähnlich wie Birkenextrakte haben auch Platanenextrakte ein vielversprechendes Potenzial bei der Behandlung von Hautkrankheiten. Während im Falle der Birke das Betulin Hauptinhaltsstoff ist, tritt bei den Platanenextrakten die Betulinsäure in den Vordergrund. Zur differenzierten Betrachtung von Birken- und Platanenextrakten erscheinen weitere Untersuchungen nicht nur von phytochemischen, sondern auch von großem pharmakologischem Wert. /

Literatur

Dewson, G,Kluck RM (2009) Mechanisms by which Bak and Bax permeabilise mitochondria during apoptosis. J Cell Sci 122:2801-2808.

Dzubak, P, Hajduch M, Vydra D, Hustova A, Kvasnica M, Biedermann D, Markova L, Urban M,Sarek J (2006) Pharmacological activities of natural triterpenoids and their therapeutic implications. Nat Prod Rep 23:394-411.

Fulda, S (2009) Betulinic acid: a natural product with anticancer activity. Mol Nutr Food Res 53:140-146.

Fulda, S (2010) Modulation of apoptosis by natural products for cancer therapy. Planta Med 76:1075-1079.

Fulda, S,Kroemer G (2009) Targeting mitochondrial apoptosis by betulinic acid in human cancers. Drug Discov Today 14:885-890.

Hänsel, R, Sticher O (2007) Pharmakognosie, Phytopharmazie. 8. Auflage, Springer-Verlag, Heidelberg.

Jäger, S, Laszczyk MN, Scheffler A (2008) A preliminary pharmacokinetic study of betulin, the main pentacyclic triterpene from extract of outer bark of birch (Betulae alba cortex). Molecules 13:3224-3235.

Laszczyk, M, Jäger S, Simon-Haarhaus B, Scheffler A, Schempp CM (2006) Physical, chemical and pharmacological characterization of a new oleogel-forming triterpene extract from the outer bark of birch (betulae cortex). Planta Med 72:1389-1395.

Meyer, U (2006). Platanencreme, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung. D. Patent. 10 2006 038 471 A1.

Schmidt, ML, Kuzmanoff KL, Ling-Indeck L,Pezzuto JM (1997) Betulinic acid induces apoptosis in human neuroblastoma cell lines. Eur J Cancer 33:2007-2010.

Weckesser, S, Laszczyk MN, Muller ML, Schempp CM,Schumann H (2010) Topical treatment of necrotising herpes zoster with betulin from birch bark. Forsch Komplementmed 17:271-273.

 

Für die Verfasser:

Dr. Ana Paula Simões-Wüst

Paracel­sus-Spital

Bergstraße 16

8805 Richterswil, Schweiz

simoes(at)paracelsus-spital.ch

Mehr von Avoxa