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RNA als Arzneistoff

Faszinierendes Konzept, aber schwer zu realisieren

12.04.2010
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Von Theo Dingermann und Ilse Zündorf, Frankfurt am Main / Vom Prinzip her eignet sich RNA optimal als Arzneistoff. RNA-Moleküle erkennen ihr Zielmolekül eindeutig und docken nie an »falschen« Strukturen an. Doch trotz intensiver Forschung haben sich die großen therapeutischen Hoffnungen bislang nicht erfüllt. Nur ein einziges RNA-Molekül ist in Deutschland als Arzneimittel zugelassen.

Wenn man heute von RNA-Arzneimitteln spricht, sind vier, zum Teil recht unterschiedliche Ansätze zu nennen: Antisense-Moleküle, Ribozyme, siRNA und Aptamere. Sie bieten einen ganz neuen Ansatz in der Therapie. Bisher zielen viele Arzneistoffe darauf ab, im Körper vorhandene Proteine an ihrer Funktion zu hindern. RNA-Arzneistoffe greifen deutlich früher ein: Sie inhibieren die Bildung von Proteinen, blockieren also Schritte in der Transkription und Translation von Genen. Dies eröffnete Visionen: Mithilfe von Nukleinsäuren könnte man die Synthese von Proteinen (Enzym, Rezeptoren, Kanäle) verhindern oder zumindest behindern anstatt die Aktivität des bereits gebildeten Proteins zu inhibieren. Doch wo liegen die Probleme?

Prinzipiell birgt RNA als pharmazeutischer Wirkstoff eine faszinierende Option: RNA steuert eine molekulare Zielstruktur »todsicher« an! Keine Interaktion von zwei Molekülen ist so genau verstanden und vorhersehbar wie die spezifische Interaktion zwischen zwei Nukleinsäuren nach dem Prinzip der von Watson und Crick entdeckten Komplementarität. Diese Regel gilt für alle Nukleinsäuren: für DNA- und RNA-Moleküle, die sich paaren, ebenso wie für ein DNA- und ein RNA-Molekül, die eine komplementäre Nukleotidsequenz aufweisen und ein sogenanntes Heteroduplex bilden können.

 

Die Paarung zwischen Adenin (A) und Thymin beziehungsweise Uracil (T, U) sowie Guanin (G) und Cytosin (C) war das Geheimnis hinter der sogenannten Chargaff-Regel, nach der in der Erbinformation jeder Spezies die Anzahl an Adenin-Basen gleich groß ist wie die Zahl der Thymin-Basen, und die Anzahl der Guanin-Basen exakt der der Cytosin-Basen entspricht.

 

Die Tatsache, dass Nukleinsäuren sich nach den festen Regeln der Komplementarität assoziieren, bietet ideale Voraussetzungen für Wirkstoffforscher. Ihr zentrales Anliegen ist es, Moleküle gezielt an den Ort einer vermeintlichen Wirkung zu dirigieren. Hinzu kommt, dass man bereits Ende der 1970er-Jahre beobachtete, dass komplementäre Sequenzen die Expression einer genetischen Information unterbinden können (18).

 

Drei der genannten Interventionsansätze – Antisense-Moleküle, Ribozyme und siRNA – finden ihre Zielstrukturen über die Komplementarität zwischen Nukleinsäuren. Mehr als 16 000 Publikationen sind seit 1978 zu diesem Themenbereich erschienen. Dennoch gibt es kein zugelassenes Medikament. 2002 wurde die Zulassung des bis dahin einzigen Antisense-Arzneimittels Vitravene® (Fomivirsen) zurückgezogen. Für einen zweiten Wirkstoff, Oblimersen (Genasense®), wurde die Zulassung beantragt, aber nicht erteilt. Die AGENDA-Studie, eine Phase-III-Studie, in der Oblimersen-Natrium bei Patienten mit fortgeschrittenen Melanomen getestet wurde, enttäuschte. Es zeigten sich keine statistisch signifikanten Vorteile beim primären Co-Endpunkt, dem progressionsfreien Überleben. Und bei den sekundären Endpunkten, der Gesamtansprechrate und der Krankheitskontrollrate, gab es ebenfalls keine statistisch signifikanten Vorteile.

 

Die Nukleinsäure-Strategie erzielte allerdings im akademischen Bereich so riesige Erfolge, dass letztlich für Teilbereiche dieser Forschung zwei Nobelpreise verliehen wurden: 1989 der Nobelpreis für Chemie an Thomas Cech und Sidney Altman für ihre Arbeiten an RNA-Enzymen (Ribozyme) und 2006 der Nobelpreis für Physiologie und Medizin an Andrew Z. Fire und Craig C. Mello für ihre Entdeckung der RNA-Interferenz – das Abschalten von Genen durch doppelsträngige RNA.

 

Antisense-Oligonukleotide

 

Bei einem DNA-Doppelstrang, der ein Gen repräsentiert, unterscheidet man den codogenen oder Matrizen-Strang (Antisense-Strang) von dem nicht-codogenen Strang (Sense-Strang). Eine mRNA ist immer mit der Sequenz des nicht-codogenen DNA-Strangs identisch und gleichzeitig komplementär zum codogenen DNA-Strang (Abbildung 1). Eine Nukleinsäure (RNA oder DNA), deren Sequenz komplementär zu einem Abschnitt einer natürlichen mRNA ist, heißt Antisense-Nukleinsäure. Analog heißt eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu einem Teil einer natürlichen mRNA ist, Antisense-Oligonukleotid.

Der Antisense-Mechanismus zur gezielten Inhibition der Proteinexpression wurde erstmals mit der FlavrSavr-Tomate kommerziell umgesetzt. Bei dieser transgenen Tomate wurde das Gen für die Polygalacturonase nochmals in umgekehrter Orientierung in die Pflanze eingebracht (14). Somit entsteht zusätzlich zur normalen mRNA für die Polygalacturonase eine zweite, dazu komplementäre »mRNA«, sodass sich ein RNA-Doppelstrang ausbilden kann und die Translation inhibiert wird. Infolge der reduzierten Proteinexpression wird die Mittellamelle der Tomatenzellen nicht mehr so schnell abgebaut. Dies ist ein normaler Vorgang, wenn die reife Tomate allmählich verdirbt. Die FlavrSavr-Tomate kam 1994 auf den Markt und war wesentlich länger haltbar als herkömmliche Tomaten. Trotzdem fand sie kaum Abnehmer und wurde 1997 wieder vom Markt genommen.

 

Ganz aktuell ist das Beispiel der Amflora-Kartoffel, für die kürzlich eine Anbaugenehmigung in der EU erteilt wurde. Hier wird die Bildung der Granula-gebundenen Stärkesynthase durch Antisense-RNA unterbunden, wodurch sich die Zusammensetzung der Stärke in der Kartoffel in Richtung Amylopektin verschiebt.

 

Therapeutisch kann man ganze Gene nicht einsetzen. Daher versuchte man, mit kürzeren Oligonukleotiden den gleichen Effekt zu erzielen. Antisense-Oligonukleotide greifen in aller Regel an funktionellen Bereichen einer RNA an. Dies sind bei einem Primärtranskript beispielsweise die Capping-Region, die Polyadenylierungsstelle oder die Intron/Exon-Übergänge. Die Inhibierung der entsprechenden biologischen Prozesse verhindert eine effiziente Ausschleusung der RNA aus dem Zellkern, eine ausreichende Stabilisierung der RNA oder die Entstehung vollinformativer RNA. Um dies zu erreichen, müssen Antisense-Oligonukleotide in ausreichender Konzentration im Zellkern akkumulieren, da die Zielstrukturen im Zellkern und nicht im Zytoplasma liegen.

 

Bevorzugte Zielstellen für Antisense-Oligonukleotide sind die Bereiche einer RNA, an der die Ribosomen zur Ausbildung eines Präinitiationskomplexes binden, und der Bereich um das erste AUG-Triplett. Das ist die Stelle, an der die Translation startet. Durch die Bindung des Komplementärstrangs werden die Funktionen inhibiert.

 

Die Erkenntnis, dass Antisense-Oligonukleotide die Genexpression beeinflussen können, bedeutete nicht, dass man auch die Prinzipien dieser Regulation verstand. Die Forscher diskutierten zwei Mechanismen:

 

die physikalische Blockade des Kopierens oder Ablesens genetischer Information, was man sich relativ leicht vorstellen kann;

die Wirkung der RNase H, die man beim Studium der molekularen Mechanismen der Replikation von Retroviren entdeckt hatte.

 

Die RNase H nutzen die Viren, wenn ihre RNA-Genome in DNA umgeschrieben werden. Dabei übersetzt zunächst die Reverse Transkriptase die genomische virale RNA in ein »Heteroduplex« aus dem ursprünglichen RNA-Strang und einen neu synthetisierten DNA-Strang. Um diesen Heteroduplex in eine doppelsträngige DNA umzuschreiben, benötigt die Reverse Transkriptase die RNase H, die den RNA-Strang hydrolytisch abbaut. Damit liegt der Matrizenstrang für die Synthese des komplementären DNA-Strangs durch die Reverse Transkriptase frei. RNase H kommt in eukaryontischen Zellen deshalb vor, weil wir uns über die Jahrmillionen etliche retrovirale Genome »eingefangen« haben, von denen einige noch soweit intakt sind, dass eine aktive RNase H codiert wird. Inzwischen kennt man viele andere Mechanismen, die die inhibitorischen Aktivitäten von komplementärer RNA vermitteln.

 

Die Fortschritte in der RNA-Chemie und die Möglichkeiten zu einem rationaleren Design von Antisense-Sequenzen waren Gründe, weshalb man nach den ersten herben Enttäuschungen die Antisense-Moleküle nicht umgehend ad acta legte. Weniger im klinischen Bereich als vielmehr in der Grundlagenforschung, zur Targetvalidierung und zur Funktionsanalyse unzureichend charakterisierter Gene und Stoffwechselwege zeigten Antisense-Strategien plötzlich das Potenzial, das man sich von ihnen versprochen hatte.

 

Ribozyme

 

Eine interessante Alternative zu Antisense-Oligonukleotiden waren bis zur Entdeckung der RNA-Interferenz die sogenannten katalytischen RNAs oder Ribozyme.

 

Das Prinzip ist immer gleich: RNA-Elemente stabilisieren eine Struktur, die dann ein aktives Zentrum bildet, in dem Phosphatesterhydrolyse katalysiert ablaufen kann. Das Prinzip der »katalytischen RNA« ist in der Natur mehrfach realisiert, unter anderem bei der sogenannten Hammerhead-RNA. Diese wurde bei spezifischen Pflanzenviren entdeckt, die als genomisches Material RNA enthalten und diese zur Verpackung in das Viruskapsid spezifisch schneiden müssen. Das erledigt die RNA selbst – ganz ohne Hilfe von Proteinen.

 

In die Klinik haben es Ribozyme noch nicht geschafft. Jedoch werden mindestens zwei Moleküle klinisch getestet: OZ1 bei HIV-Infektion und Angiozyme, ein anti-FLT-1-Ribozym, zur Behandlung eines Nierenzellkarzinoms.

 

Aptamere

 

Aptamere sind bemerkenswerte RNA-Moleküle: Sie können, ähnlich wie Antikörper, mit fast jeder beliebigen Oberfläche von Biomolekülen interagieren. Allerdings beruht diese Interaktion nicht auf dem klassischen Watson/Crick-Komplementaritätsprinzip. Vielmehr bilden die RNA-Moleküle über intramolekulare Basenpaarungen dreidimensionale Strukturen, die dann hoch spezifisch passende Oberflächenformen erkennen und binden (4).

Die Bezeichnung »Aptamer« setzt sich zusammen aus dem lateinischen Ausdruck »aptus« für passend und dem griechischen »meros« für Teilchen. Aptamere werden durch einen In-vitro-Selektionsprozess gewonnen (SELEX: Systematic Enrichment of Ligands by Exponential Amplification). Hierzu werden Nukleinsäure-Bibliotheken erstellt, die bis zu 1016 unterschiedliche Moleküle umfassen. Diese Nukleinsäuren sind dadurch gekennzeichnet, dass sie einen randomisierten Sequenzabschnitt zwischen zwei flankierenden konstanten Regionen enthalten (Abbildung 2). Die variablen Sequenzabschnitte stellen unterschiedliche Oberflächen für die Interaktion mit dem Zielmolekül dar; die konstanten Bereiche an den Enden ermöglichen die spätere Vervielfältigung der Nukleinsäure durch Polymerase-Kettenreaktion. Die Nukleinsäure-Bibliotheken werden durch wiederholte Zyklen selektioniert, wobei sich ein Zyklus aus den folgenden Schritten zusammensetzt (Abbildung 2):

 

Inkubation mit einem Zielmolekül,

Abtrennung gebundener von nicht-gebundenen Nukleinsäuren und

Amplifikation der gebundenen Nukleinsäuren.

 

Nach sechs bis 20 Selektionszyklen reichern sich diejenigen Moleküle an, die an das gewünschte Zielmolekül mit hoher Affinität und Spezifität binden.

 

Etliche Aptamere werden in klinischen Studien getestet, zum Beispiel REG1, das gegen den Gerinnungsfaktor IXa gerichtet ist, oder EYE001 gegen den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor VEGF. Mit Pegaptanib (Macugen®) ist seit 2006 tatsächlich einer dieser Wirkstoffe zugelassen: zur Behandlung der neovaskulären (feuchten) altersabhängigen Makuladegeneration (AMD). Pegaptanib ist ein pegyliertes modifiziertes Oligonukleotid, das hoch spezifisch und mit hoher Affinität an den extrazellulären vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF165) bindet und dessen Wirkung hemmt.

 

RNA-Interferenz

 

Eine der aufregendsten Entdeckungen der letzten Jahre ist das Phänomen der RNA-Interferenz (RNAi) (5, 10). Erst vor zehn Jahren wurde dieses Prinzip bei dem Fadenwurm Caenorhabditis (C.) elegans beobachtet und bereits 2006 mit dem Nobelpreis ausgezeichnet.

 

Wie bei Antisense-Molekülen und Ribozymen basiert auch die RNAi-Strategie auf der Watson/Crick-Komplementarität zwischen einer kurzen RNA und einer entsprechenden Ziel-RNA, in aller Regel einer mRNA. RNA-Interferenz ist in der Evolution über einen weiten Bereich konserviert: von Pflanzen über Neurospora, Drosophila, C. elegans bis hin zu den Säugern. Dies verdeutlicht, wie wichtig dieses System ist.

 

Das RNAi-Prinzip basiert natürlicherweise auf doppelsträngiger RNA (dsRNA), die entweder während einer viralen Infektion bei der Virusvermehrung auftritt oder die von mikroRNA (miRNA) gebildet wird. Diese spezielle RNA-Spezies wurde ebenfalls erst kürzlich entdeckt und ist physiologischer Bestandteil des Genoms (1).

RNA-Viren wie das Influenza- oder das Hepatitis-C-Virus haben doppelsträngige RNA als Replikationsform. Säugerzellen können sich sehr effektiv gegen eine Virusinfektion wehren: durch Interferon-induzierte Hemmung der Proteinsynthese und über die RNAi. In diesem Fall wird die virale dsRNA im Zytoplasma von einem dsRNA-spezifischen RNAse-Komplex erkannt, der DICER genannt wird (Abbildung 3). DICER schneidet aus der dsRNA kleine doppelsträngige RNA-Stücke heraus, die typischerweise 20 bis 25 Basenpaare lang sind, am 5’-Ende eine Phosphatgruppe tragen und am 3’-Ende um zwei Basen überstehen. Die kurzen dsRNA-Fragmente werden small interfering RNA (siRNA) genannt. Die siRNA werden dann von einem weiteren Enzymkomplex namens RISC (RNA-induced silencing complex) gebunden. Der RISC entwindet den siRNA-Doppelstrang und sucht dann mit jeweils einem der beiden RNA-Einzelstränge nach komplementären mRNA-Sequenzen in der Zelle. Werden solche identifiziert, wird diese mRNA durch RISC abgebaut (2). Somit steht die mRNA nicht mehr für die Proteintranslation zur Verfügung, das heißt, dass die Menge des von der mRNA codierten Proteins in der Zelle abnimmt.

 

Es handelt sich bei der RNA-Interferenz also um eine posttranskriptionelle Down-Regulation der Proteinexpression. Die Replikation von RNA-Viren wird selektiv dadurch unterbunden, dass die RNAi-Maschinerie aus der viralen dsRNA-Replikationsform siRNA produziert und mit deren Hilfe die viralen RNA degradiert.

 

Mittlerweile wird auch diskutiert, dass die früher bei Antisense-Ansätzen, zum Beispiel bei der FlavrSavr-Tomate, beobachteten Effekte weniger auf der physikalischen Inhibition der Translation beruhen, sondern ebenfalls durch RNA-Interferenz bedingt sind (13).

 

RNA-Interferenz in der Forschung

 

Für die pharmazeutisch/medizinische Grundlagenforschung hat sich die RNAi-Technologie als überaus hilfreich erwiesen. Sie wird die »Knock-out-Technologie«, das Zerstören bestimmter Gene beispielsweise durch die Insertion von DNA-Sequenzen in die codierende Region, ergänzen und teilweise auch ablösen.

 

Mithilfe von Knock-out-Tieren studierten Forscher bislang die Rolle von unterschiedlichen Genen und deren Produkten in Zellen und Organismen. Der Aufwand, derartige Tiere herzustellen, ist jedoch enorm. Hier ist die siRNA-Technologie um ein Vielfaches effizienter, sodass sich ihr Einsatz bei der Suche nach »Druggable Targets« förmlich aufdrängt.

 

Um eine siRNA-Aktivität über längere Zeit in einer Zelle oder einem Organismus aufrechtzuerhalten, haben sich Vektor-basierte Systeme bewährt. Mit ihrer Hilfe kann die genetische Information für die siRNA stabil in eine Zelle integriert werden (17). Diese Vektoren enthalten die genetische Information für sogenannte Tandem-siRNA oder short hairpin-siRNA (shRNA), die durch DICER geschnitten werden und sich dann zu dsRNA zusammenfügen.

 

Mit derartigen Konstrukten lässt sich die Biosynthese genau definierter Genprodukte hemmen und somit deren Relevanz für Stoffwechsel- und Signaltransduktionswege relativ schnell und zuverlässig bestimmen (16). Auf Basis dieser Daten können Wirkstoffe jeglichen Typs entworfen werden – darunter auch Wirkstoffe, die spezielle RNA-Moleküle als Zielstrukturen ansteuern und deren Umsetzung in Proteine blockieren.

 

Vom Labor zur Therapie

 

Vom chemischen Standpunkt aus betrachtet ist RNA ein indiskutables Molekül für einen therapeutischen Wirkstoff. Das liegt zum einen am Überschuss an negativen Ladungen und der damit verbundenen hohen Polarität, die eine Bioverfügbarkeit unwahrscheinlich erscheinen lässt. Relevanter noch ist die enorme chemische Instabilität, die vielfach höher ist als die der DNA. Dies wiederum liegt an der 2’-OH-Gruppe in der Ribose, die zu einer Destabilisierung der 3’-5’-Diesterbindung führt. Daher ist RNA eines der sensibelsten Biomoleküle, mit denen es Biochemiker zu tun bekommen können.

 

Was lag also näher, als RNA chemisch so zu modifizieren, dass diese molekularen Nachteile aufgehoben wurden? Das gelang auf unterschiedliche Weise, beispielsweise indem die 2’-OH-Gruppe modifiziert wurde, die Phosphatdiester-Funktion in die deutlich stabilere Phosphothioat-Funktion umgewandelt wurde, oder ein Morpholino-Rückgrat, ein ungeladenes Peptidrückgrat (PNA) oder ein »blockiertes« RNA-Rückgrat (LNA) eingeführt wurden (Abbildung 4).

Obwohl diese Modifikationen zu einer teils deutlich besseren Bioverfügbarkeit (sowohl hinsichtlich Aufnahme als auch Stabilität) führten, beobachtete man auch unerwartete Probleme. Diese waren meist unabhängig von der Sequenz und somit klar strukturabhängig, sodass praktisch alle Oligonukleotide davon betroffen waren. Beispielsweise zeigten die Phosphothioate wegen ihrer negativen Ladung eine hohe Tendenz zur unspezifischen Proteinbindung, was unter anderem durch Bindung von Thrombin zu Koagulopathien führte (7). Ferner neigen Phosphothioate dazu, in der Leber zu akkumulieren, was sich durch pathologische Leberwerte bemerkbar macht. Auch wirkten viele Wirkstoffkandidaten immunmodulatorisch. Dennoch wurden diese sequenzunabhängigen unerwünschten Wirkungen als tolerabel gestuft, wenn mit den Wirkstoffen bislang unerfüllte medizinische Ziele (»unmet medical needs«) erreicht wurden.

 

Anders sieht es aus mit sequenzabhängigen unerwünschten, in erster Linie immunologischen Arzneimittelwirkungen, die ebenfalls unerwartet auftraten, heute aber sehr gut erklärbar und daher weitestgehend vermeidbar sind. Erst 1990 entdeckte man, dass bestimmte Teilsequenzen in Antisense-Oligonukleotiden eine ganz erhebliche Immunantwort induzieren können. Die verantwortlichen Sequenzen sind entweder unmethylierte Cytosin-Guanin- oder Polyguanin-(GGGG)-Motive. Sie sind Liganden des sogenannten Toll-verwandten (Toll-like) Rezeptors 9 (TLR 9).

 

Unmethylierte CG-Dinukleotide sind klassische mikrobielle »Muster«. Die meisten Bakterien haben CG-Dinukleotide in der zu erwartenden statistischen Häufigkeit von 1 : 16 im Genom codiert, während bei Vertebraten nur noch ein Fünftel dieser CG-Dinukleotide vorkommt (CG-Suppression). Zusätzlich sind die Cytosine innerhalb des CG-Dinukleotids bei Vertebraten im Gegensatz zu Bakterien an der Position 5 methyliert (m5CG). Aufgrund dieser Unterschiede erkennt das Immunsystem bakterielle Erreger und startet Abwehrreaktionen.

 

Kurze Polyguanin-Abfolgen (GGGG-Motive) in RNA-Wirkstoffen verursachen unerwünschte Wirkungen, weil sie vermehrt von Makrophagen aufgenommen werden, wo sie eine starke Immunantwort induzieren.

 

Die immunmodulatorischen Eigenschaften können für spezielle immunologische oder tumorassoziierte Indikationen durchaus interessant sein und werden daher auch weiterentwickelt (6). Für ein spezifisches Targeting von RNA- oder DNA-Sequenzen waren diese »Randerscheinungen« hingegen höchst kontraproduktiv und versetzten einer zügigen Weiterentwicklung des therapeutischen Antisense-Ansatzes einen herben Rückschlag. Dennoch werden etliche Antisense-Oligonukleotide in klinischen Studien getestet (Tabelle 1).

Tabelle 1: Auswahl von Antisense-Oligonukleotiden in klinischen Studien

Wirkstoff, Hersteller Chemie* Zielstruktur Krankheit
Phase I
EZN-2968, Enzon Pharmaceuticals LNA Hif-1α Krebs
OGX-427, ISIS/OncoGeneX MBO Hsp27 Krebs
LY225796, Eli Lilly MOE eIF-4E Krebs
Phase I/II
AVI-4658, AVI Pharma PMO Dystrophin Duchenne
Muskeldystrophie
LErafAON, NeoPharm PS c-Raf Krebs
ASM8-003, Topigen Pharmaceuticals PS CCR3 und gemeinsame Kette der
IL-3/5- und GM-CSF-Rezeptoren
Allergien/Asthma
AEG 35156, Aegera Pharma MBO XIAP Krebs
ISIS 325568, ISIS/Ortho-McNeil MOE Glucagon-Rezeptor Typ-II-Diabetes
Phase II
ISIS 104838, ISIS/Orasense PS TNF-α Rheumatoide Arthritis
ISIS 5132, ISIS PS c-Raf Krebs
ISIS 2503, ISIS PS H-Ras Krebs
ISIS 113715, ISIS MOE PTP-18 Diabetes
ISIS 301012, ISIS MOE Apo-B100 Kardiovaskuläre Erkrankung (hohes Cholesterol)
G4460/LR 3001, Inex/Genta PS c-Myb Krebs
GTI-2040, Lorus Therapeutics PS Ribonukleotid-Reduktase R2 Krebs
AP12009, Antisense Pharma PS TGF-βII Krebs
ATL1102, ISIS/Antisense Therapeutics Ltd MOE VLA-4 (CD94d) Multiple Sklerose
Phase II/III
Genasense (Oblimersen/G3139), Genta PS Bcl-2 Krebs
Phase III
Alicaforsen (ISIS 2302),
ISIS/Atlantic Healthcare
PS ICAM-1 Morbus Crohn, IBD

*) PMO: Morpholino-Oligonukleotid; PS: Phosphothioat; LNA: blockierte Nukleinsäure; MBO: gemischte Rückgrat-Modifikation; MOE: Methoxyethyl-phosphothioat

Auch der RNA-Interferenz-Ansatz wird hinsichtlich seines therapeutischen Potenzials überprüft. Etliche Moleküle befinden sich in der klinischen Forschung, darunter RNAi-Moleküle gegen Interleukin 10 (IL-10) zur Behandlung der Präeklampsie, RNAi-Moleküle gegen den VEGF oder den VEGF-Rezeptor zur Behandlung der altersbedingten feuchten Makuladegeneration, und RNAi-Moleküle gegen BCR-ABL-Transkripte, die bei chronisch myeloischer Leukämie (CML) eingesetzt werden könnten (8). Beispiele für Wirkstoffe in klinischer Prüfung zeigt die Tabelle 2.

Tabelle 2: Laufende und abgeschlossene klinische Studien mit siRNA

Wirkstoff/Hersteller Krankheit Applikationsweg
Phase I
NUC B1000/Nucleonics Hepatitis-B-Virus Systemisch
Phase Ia/b
TD101/TransDerm Pachyonychia congenita Topisch
Phase I/IIa
QPI-1002/Quark Pharmaceuticals/
Pfizer
Akutes Nierenversagen Systemisch
Phase II
AGN211745/Allergan AMD Topisch
ALN-RSV01/Alnylam Respiratorisches
Syncytial Virus-Infektion
Lokal/direkt
RTP801i/Silence/Quark/Pfizer AMD Topisch
Phase III
Bevasiranib/Opko Health AMD Topisch
Beobachtungsstudie
SV40/MDR1/Hadassah
Medical Organization
Chronisch myeloische
Leukämie (CML)
Systemisch
(SV40-Vektor)

AMD: Altersabhängige Makuladegeneration

Trotz aller Plausibilität ist beim therapeutischen Einsatz von small interfering RNA Skepsis angesagt. Denn auch siRNA, die als Duplex appliziert wird, stimuliert das angeborene Immunsystem, besonders dann, wenn die doppelsträngigen RNAs mehr als 30 Basenpaare enthalten. Diese aktivieren die endosomalen Toll-like-Rezeptoren 7 und 8, wodurch immunologische Reaktionen induziert werden. Außerdem kann »nackte«, also unmodifizierte siRNA auch den TLR-3-Weg auf vaskulären Endothelzellen aktivieren. Somit könnten die in Studien beobachteten antiviralen, antiangiogenen oder antiinflammatorischen Effekte weniger auf die Anwendung der spezifischen siRNA als vielmehr auf die Aktivität des unspezifischen Immunsystems zurückzuführen sein.

 

Auf einen kritischen Evaluationsansatz wiesen kürzlich kanadische Wissenschaftler hin (12, 19). Sie konnten zeigen, dass die getesteten siRNAs in der Zellkultur zwar die erwarteten Effekte induzierten, in Mausmodellen jedoch auch unerwartete und zudem unerwünschte Wirkungen auftraten. Aus ihren Resultaten folgerten die Wissenschaftler, dass die meisten Studien Mängel aufweisen:

 

Zum Teil wurden Zellen verwendet, die nicht auf unspezifische Immunstimuli reagieren können.

Die Zytokinkonzentration wurde zu Zeitpunkten gemessen, die deren schnelle und transiente Induktion verpassten.

Zum Teil wurde nur eine Zytokinklasse untersucht und daraus auf eine fehlende Immunantwort geschlossen.

Nur eine siRNA-Sequenz – nie die aktive und die Kontrollsequenz – wurde auf ihr immunstimulierendes Potenzial getestet.

 

Zwischenzeitlich hat man Regeln erarbeitet, welche Strukturmerkmale siRNAs haben sollten, um möglichst spezifisch und effizient zu wirken (Abbildung 5). Danach kann man sagen, dass die RNA einen Doppelstrangbereich von 19 Basenpaaren aufweisen, an beiden Enden jeweils ein zwei Basen langer 3‘-Überhang vorhanden sein und an bestimmten Positionen ganz spezifische Basen vorliegen sollten (9, 11).

Bevor siRNAs als Arzneistoffe wirklich attraktiv werden, muss dafür gesorgt werden, dass der Wirkstoff auch sein Ziel findet. Eine Möglichkeit ist die lokale Applikation, zum Beispiel bei der AMD-Behandlung durch Injektion in den Glaskörper oder die Applikation direkt in einen soliden Tumor. Dagegen stellen die nur systemisch erreichbaren Zielstrukturen die pharmazeutischen Technologen vor echte Herausforderungen. Plausible Konzepte haben ihr Potenzial bisher fast ausschließlich in Tiermodellen angedeutet.

 

Große Hoffnungen setzt man beispielsweise auf Nanopartikel, Liposomen und modifizierte Oligonukleotide. Dabei zielen die Modifikationen nicht so sehr auf eine Erhöhung der chemischen Stabilität, sondern auf eine bessere Bioverfügbarkeit ab. Ein Beispiel sind Cholesterol-Konjugate: Bindet man Cholesterol über einen Linker an den Sense-Strang eines siRNA-Doppelstrangs, wird dieses Molekül von einigen Zellen, zum Beispiel Hepatozyten, leichter aufgenommen.

 

Die Therapie mit RNA-Molekülen – ob Antisense-RNA, Aptamere, Ribozyme oder siRNA – sollte man keineswegs abschreiben. Im Gegenteil: Das Potenzial ist gewaltig. Allerdings gilt es, Rückschläge durch voreilig eingeleitete klinische Studien zu vermeiden, um diesem Therapieansatz nicht durch spektakuläre Fehlschläge seine Chance zu nehmen. /

Literatur

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Die Autoren

 

Theodor Dingermann studierte Pharmazie in Erlangen. Nach der Approbation 1976 folgten Promotion und 1987 Habilitation. Seit 1991 ist er geschäftsführender Direktor des Instituts für Pharmazeutische Biologie an der Goethe-Universität Frankfurt am Main. Dingermann war von 2000 bis 2004 Präsident der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft, arbeitet in zahlreichen wissenschaftlichen Gremien, leitet seit 1992 die Arbeitsgruppe »Biotechnologisch hergestellte Arzneimittel« der Arzneibuch-Kommission beim BfArM und ist bis 2010 Mitglied der Kommission. Ende 2009 wurde Dingermann zum »Professor des Jahres« in der Kategorie Naturwissenschaften und Medizin gewählt. Die Apotheker kennen ihn zudem als Referenten bei Fortbildungstagungen sowie als Autor und Co-Autor mehrerer Lehrbücher. Seine Hauptforschungsgebiete umfassen Konzepte für die Verbesserung heutiger Gentherapie-Vektoren sowie die Identifizierung von Zielproteinen von Arzneistoffen durch Arzneistoff-Proteomik.

 

Ilse Zündorf studierte Biologie von 1984 bis 1990 an der Universität Erlangen. Nach einem Forschungsaufenthalt an der University of Kentucky, Lexington, USA, wurde sie 1995 am Institut für Pharmazeutische Biologie der Universität Frankfurt promoviert. Zunächst als Akademische Rätin, seit 2001 als Akademische Oberrätin arbeitet sie am Institut für Pharmazeutische Biologie der Goethe-Universität Frankfurt. Ihre Forschungsthemen betreffen Herstellung und Charakterisierung monoklonaler Antikörper gegen Proteine und Naturstoffe, Herstellung und Modifikation rekombinanter Antikörperfragmente sowie die Etablierung von zellulären Testsystemen zur Wirkstoffsuche.

 

Professor Dr. Theo Dingermann und Dr. Ilse Zündorf

Institut für Pharmazeutische Biologie

Biozentrum, Max-von-Laue-Str. 9

60438 Frankfurt am Main

Dingermann(at)em.uni-frankfurt.de

zuendorf(at)em.uni-frankfurt.de

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