Wie gefährlich sind Nitrosamine?

Dass Arzneimittel mit Nitrosaminen verunreinigt sind, hat Synthesechemiker und vielleicht auch manchen Analytiker nicht unbedingt verwundert, aber die Bevölkerung war alarmiert, vor allem, weil in der Folge in weiteren Arzneimitteln Nitrosamine gefunden wurden. Für den Lebensmittelchemiker ist eine solche Kontamination allerdings nichts Besonderes, da in vielen Nahrungsmitteln Nitrosamine enthalten sind oder durch Prozessierung und Kochen gebildet werden. Wie ernst sind die gefundenen Nitrosamin-Mengen in Arzneimitteln und warum ist es überhaupt dazu gekommen?

Die Qualität, sprich die Reinheit von Arzneimitteln wird seit Jahrhunderten in Arzneibüchern geregelt. Heutzutage spielt das Europäische Arzneibuch (PhEur) eine große Rolle. Es limitiert die in einem Arznei- oder Hilfsstoff erlaubte Art und Menge an Verunreinigungen und beschreibt die Methoden, mit denen man deren Konzentration messen kann. Dabei werden im Wesentlichen Restlösemittel, Schwermetalle und verwandte Substanzen bestimmt.

Das PhEur wird am »European Directorate for the Quality of Medicines and HealthCare« (EDQM) erarbeitet, wobei insbesondere für neuere Arzneistoffe die Richtlinien der »International Conference on Harmonization« (ICH) bei der Erstellung einer Monographie eine Rolle spielen. Ein Hersteller von Arzneistoffen kann beim EDQM ein sogenanntes CEP beantragen, also ein »Certificate of Suitability to the Monograph of the European Pharmacopoeia«.

Die Zertifizierungsabteilung des EDQM prüft dann die eingereichten Chargen des Arzneistoffs nach den Regeln des PhEur, um festzustellen, ob der Arzneistoff der dort beschriebenen Qualität entspricht. Ist dies der Fall, wird das CEP erteilt, mit dem der Hersteller nun seine qualitätsgesicherte Ware auf dem Markt anbieten kann.

Im Juli 2018 wurde Valsartan im Wesentlichen bei der chinesischen Firma Zhejiang Huahai Pharmaceutical produziert; ein zweiter Hersteller war Heterolabs India. Beide Firmen verfügten über ein gültiges CEP des EDQM, sodass eigentlich die Qualität gesichert sein sollte. Mehr durch Zufall wurde die Substanz in Spanien näher untersucht und dabei wurden die Nitrosamine gefunden. Mehr zu den akuten Folgen des »Valsartan-Skandals« für die Apothekenpraxis lesen Sie im Beitrag »Ein Jahr mit dem Valsartan-Störfall«.

Die im PhEur beschriebene Analytik war zu diesem Zeitpunkt nicht in der Lage, Nitrosamine nachzuweisen, geschweige denn zu quantifizieren. Dies liegt daran, dass Nitrosamine weder strukturell verwandt mit Sartanen sind noch in die Kategorie Restlösemittel fallen. Bei Verdacht auf eine Verunreinigung hätte die ICH-Richtlinie M7 zur »Bewertung und Überwachung von DNA-reaktiven (mutagenen) Verunreinigungen in pharmazeutischen Produkten« (1) angewendet werden müssen, aber weder die Analytiker der Herstellerfirmen noch das EDQM hatten einen Verdacht. Allerdings sei betont, dass die Synthese, auf deren Grundlage die Arzneibuchmonographie erarbeitet wurde und die Vergabe des CEP beruhte, keine Hinweise auf eine mögliche Entstehung von Nitrosaminen gab.

Bei der chinesischen Firma Zhejiang hatten die organischen Chemiker den Syntheseschritt zum Aufbau des Tetrazolyl-Restes optimiert, ohne die Information weiterzugeben. Statt des vorher genutzten Zinnazids wurde nun Natriumazid im Lösungsmittel Dimethylformamid (DMF) eingesetzt und der Azid-Überschuss nach abgelaufener Reaktion mit Natriumnitrit zerstört (2) (Abbildung 1). Dabei wurde nicht bedacht, dass DMF in der Hitze in Kohlenmonoxid und Dimethylamin zerfällt, eine Reaktion, die eigentlich jeder Organiker kennt und die sogar in Wikipedia nachzulesen ist (3). Das sekundäre Amin reagierte dann mit Nitrit zu N-Nitrosodimethylamin (NDMA) (Abbildung 1 unten). Und weil DMF noch andere Amine enthält, wurden in der Folge weitere Nitrosamine, unter anderem N-Nitrosodiethylamin (NDEA), in Valsartan gefunden.

Hier ist also nicht nur die Chemie schiefgelaufen. Die Behörden wurden über die Änderung der Herstellung nicht informiert, was eine grobe Missachtung der internationalen Regularien darstellt. Nach dem Nachweis von NDMA wurden allen Herstellern umgehend die CEP für alle Tetrazolyl-substituierten Sartane entzogen.

Da 2018 niemand wusste, wie lange Hypertoniepatienten schon die kontaminierten Sartane eingenommen hatte, musste schnell gehandelt werden. Die FDA nahm binnen weniger Wochen ein Audit in China vor und stellte dabei zahllose Mängel in der Produktion fest. Der vielleicht gravierendste war die Tatsache, dass die Qualitätsanalytiker schon seit Längerem einen unbekannten Peak in den Chromatogrammen gesehen hatten, diesem Befund aber nicht nachgegangen waren. Auch das verstößt gegen alle internationalen Regeln, die offenbar nicht alle Analytiker bei Zhejiang kannten.

Auch das EDQM und die European Medicines Agency (EMA) auditierten die Sartan-Hersteller. Zur Aufklärung der gesamten Sachverhalte und zur Verbesserung der Sartan-Qualität arbeiteten sie in der Folge mit den Herstellern eng zusammen.

Zum Zeitpunkt der Entdeckung von NDMA und weiteren Nitrosaminen in Valsartan gab es keine empfindliche Nitrosamin-Analytik, die den Ansprüchen des Arzneibuchs genügt hätte. Das vom EDQM koordinierte internationale Netzwerk von sogenannten »Official Medicine Control Laboratories« (OMCL) hat zügig verschiedene analytische Methoden zur Evaluation entwickelt. Eine ausreichend große Empfindlichkeit wurde nur durch eine Kombination aus Hochleistungsflüssigkeits- und Gaschromatografie mit massenselektiven Detektoren erzielt.

Die für das PhEur ungewöhnliche Toolbox von jetzt optimierten und validierten HPLC- und GC/MS-Methoden lässt dem Hersteller für die Qualitätsanalytik eine gewisse Wahl. Ungewöhnlich ist auch, dass die Arzneistoffhersteller nun eine Risikobewertung ihres Herstellungsprozesses bezüglich der möglichen Entstehung von Nitrosaminen vornehmen müssen und dass die Menge an Nitrosaminen so klein wie möglich sein muss. Außerdem muss eine Kontrollstrategie zur Quantifizierung der Nitrosamine implementiert werden.

Die so überarbeiteten Sartan-Monographien treten im April 2021 in Kraft. Dementsprechend müssen nun die CEP angepasst werden (5). Eine detaillierte Zusammenfassung findet sich auf der Webseite der EDQM: »The EDQM’s response to nitrosamine contamination« (6).

2018/2019 wurden am Institut für Pharmazeutische und Biomedizinische Forschung in Nürnberg in Kooperation mit der Uni Würzburg etwa 150 Packungen gekaufter Sartan-Tabletten mittels einer sehr empfindlichen selbst entwickelten HPLC/MS-Methode untersucht. Deutlich mehr als die Hälfte der Tabletten enthielt mehr NDMA, als die EMA im Februar 2019 zugelassen hatte (7). Pro Tablette Valsartan wurden zwischen 0,001 µg und 22,0 µg NDMA gefunden, was teilweise ein Vielfaches der erlaubten Menge darstellt. Auch NDEA wurde gefunden, aber selten über den erlaubten Grenzwerten.

In allen anderen Tetrazolyl-haltigen Sartanen wurden hingegen zahlen- und mengenmäßig deutlich weniger Nitrosamine gefunden. Dies steht im Einklang mit den OMCL-Untersuchungsergebnissen der Sartan-Wirkstoffe.

In einem Übersichtsartikel berichten die Autoren von früheren NDMA-Kontaminationen in diversen Arzneistoffen wie Amitriptylin, Imipramin, Trimipramin, Chlorpromazin, Promazin, Chloramphenicol, Erythromycin, Oxytetracyclin und anderen mehr (9). Auch in den letzten beiden Jahren wurde über mit Nitrosaminen kontaminierte Arzneistoffe berichtet (8):

• In Pioglitazon wurde NDMA gefunden, das aus der Verwendung von Natriumnitrit in einem früheren Syntheseschritt und DMF in einem späteren Schritt resultierte. Nähere Untersuchungen waren nicht möglich, da kein ausreichendes kontaminiertes Material zur Verfügung stand.
• Auch in Metformin-Tabletten wurde NDMA gefunden, allerdings nicht im Arzneistoff selber. In der einstufigen Metformin-Synthese wird Dimethylamin als Ausgangsstoff verwendet, das mit einem Nitrit aus einem Hilfsstoff der Tablette reagiert. Die EMA empfiehlt eine Testung der Tabletten, bevor sie auf den Markt gebracht werden. Patienten sollen Metformin einstweilen weiter einnehmen. Eine endgültige Risikobewertung sollte im März 2021 stattfinden (22).
• Rifampicin ist häufig mit Nitroso-methyl-piperazin (MeNP) kontaminiert, da im vorletzten Syntheseschritt ein Nitrit, meist Isoamylnitrit, und im letzten Schritt 1-Amino-4-methylpiperazin eingesetzt werden, die dann miteinander das Nitrosamin bilden. Eigene, bisher unpublizierte Untersuchungen des Präparats »Ricin« aus Tansania haben gezeigt, dass die erlaubte Nitrosamin-Dosis (FDA-Grenzwert 0,16 ppm) um ein Vielfaches überschritten sein kann (bis zu 5 ppm).

Es ist schon lange bekannt, dass Ranitidin eine sehr instabile Substanz ist. Allerdings wurde bis 2019 nie über die Bildung von NDMA während der Lagerung berichtet. In diversen Ranitidin-Chargen wurden nun substanzielle Mengen NDMA gefunden, was auf die Instabilität des Wirkstoffs zurückzuführen ist, da während der Lagerung die NDMA-Konzentration zunimmt, insbesondere bei Temperaturen über 25 °C (10).

Anfänglich wurden bei der amerikanischen Online-Apotheke Valisure deutlich zu hohe NDMA-Konzentrationen gemessen, da man die Probe zur Analyse erhitzt und damit die NDMA-Bildung provoziert hatte. Da aber auch Messungen beim EDQM signifikante – wenn auch deutlich niedrigere – Mengen an NDMA in Raniditin ergeben hatten, wurde der Wirkstoff gänzlich vom Markt genommen (11).

Die Bildung von NDMA aus Ranitidin in Kläranlagen durch die oxidative Wasseraufbereitung mittels Ozonisierung, Chloraminierung oder Chlorierung ist schon länger bekannt (12), ebenso die mögliche Bildung von NDMA im sauren Medium des Magens (13). Die Bildung der Nitrosamine im Wirkstoff ist noch nicht endgültig geklärt, aber es spricht vieles dafür, dass Ranitidin-Hydrochlorid sich selbst »auffrisst«: Im sauren Medium (Hydrochlorid!) bildet das Nitro-substituierte Ostende (Abbildung 2) ein Nitrosylchlorid (Cl-N=O), das mit der Dimethylaminogruppe am Westende zu einem Nitrosamin reagiert, das dann freigesetzt wird (14).

Diese Reaktion könnte man verhindern oder zumindest verlangsamen, wenn man Ranitidin nicht als Hydrochlorid einsetzt. Dafür spricht die Tatsache, dass Nizatidin, das ebenfalls eine Nitrogruppe und eine Dimethylaminogruppe an gegengesetzten Enden des Moleküls enthält, aber nicht als Hydrochlorid formuliert wird, diese Zersetzung nicht zeigt. Das in Nizatidin gefundene NDMA (15) stammt wohl aus anderen Quellen (14).

Es lässt sich also zusammenfassen, dass Nitrosamine nicht nur in der Synthese ihren Ursprung haben, sondern auch durch die Zersetzung eines Arzneistoffs entstehen können. Selbst Reaktionen zwischen Verunreinigungen von Wirk- und Hilfsstoffen können die Ursache sein. Eine weitere mögliche Quelle: Gebrauchte Lösungsmittel werden in der Pharmaindustrie in großem Maßstab zur Wiederverwendung redestilliert. So wundert es nicht, dass NDMA in Sartanen bei Herstellern gefunden wurde, obgleich diese eine Synthese verwendeten, die die Bildung von Nitrosaminen ausschließt (16).

Man muss kein Hellseher sein, um zu prognostizieren, dass noch mehr dieser Fälle auftauchen werden. Daher werden derzeit die Strukturen aller Arzneistoffe und auch die Synthesen in Bezug auf eine potenzielle Gefahr der Nitrosamin-Bildung näher untersucht.

Lebensmittel, Wasser und andere Produkte enthalten Nitrosamine, wenn auch in geringen Mengen (Kasten). Die mit Arzneimitteln eingenommenen Nitrosamine erhöhen deren Konsum. So nimmt man laut FDA beim Verzehr eines 1-kg-Steaks die gleiche Dosis NDMA zu sich wie bei der Einnahme einer Ranitidin-Tablette, nämlich circa 700 ng (17). Natürlich geht von der regelmäßigen Einnahme von Ranitidin eine größere Krebsgefahr aus als von einem gelegentlich verzehrten 250-g-Steak.

Die Internationale Agentur für Krebsforschung stuft NDMA als wahrscheinlich krebserregend ein. Dies ist chemisch darauf zurückzuführen, dass aus Nitrosaminen mittels CYP-Enzymen wie CYP2A(6) und CYP2E1 Halbaminale gebildet werden, die Formaldehyd und Stickstoff abspalten und letztlich zur Bildung hoch reaktiver Methylkationen führen (Abbildung 3). Diese reagieren leicht im Sinne einer nukleophilen Substitution mit den Stickstoffen, zumeist der Guanine, zu DNA-Addukten.

Welches Krebsrisiko davon ausgeht, lässt sich nur durch aufwendige Langzeitstudien an einer sehr großen Zahl von Versuchstieren, meist Mäusen und Ratten, ermitteln. Solche Kanzerogenitätsstudien liegen nur für ein Drittel der etwa 300 bekannten Nitrosamine vor und die Datenlage reicht für die meisten nicht für eine Risikobewertung aus. NDMA und NDEA wurden intensiv in Tieren untersucht und ihr hohes kanzerogenes Potenzial wurde gezeigt: Sie führen zu Leberkrebs. Deshalb kann die maximale Dosis bestimmt werden, »die theoretisch einen zusätzlichen Krebsfall bei 100.000 lebenslang täglich exponierten Menschen bewirkt« (18). Aus den publizierten Tierdaten kann die tägliche lebenslange Maximaldosis für einen 50 kg schweren Menschen extrapoliert werden; diese hat Eingang in die genannten Valsartan-Grenzwerte im PhEur von 96 ng NDMA (0,3 ppm) und 26,5 ng NDEA gefunden, die allerdings nur gelten, wenn keine Kontamination mit mehreren Nitrosaminen stattfindet.

Auch wenn es noch weiterer intensiver Untersuchungen bedarf, kann man nun das Krebsrisiko hochrechnen, da wir heute wissen, dass mit NDMA verunreinigtes Valsartan von 2012 bis 2018 auf dem Markt war. Selbst bei sehr hohen NDMA-Kontaminationen errechnen Frötschl et al. (18) nur ein extrem kleines Lebenszeitrisiko von 0,069 Prozent. Demgegenüber stehen Zahlen, dass in Deutschland im Lauf des Lebens einer von zwei Menschen an Krebs und einer von 88 Männern und eine von 190 Frauen an Leberkrebs erkranken.

Diese an sich günstige Prognose wird bestätigt durch eine Studie, bei der im dänischen Gesundheitsregister Patienten verglichen wurden, die mit oder ohne NDMA-kontaminiertem Valsartan behandelt worden waren. Es gab keine Erhöhung der Gesamt-Krebszahlen (19).

Wie eingangs erwähnt, waren Synthese-Chemiker von der Nitrosamin-Kontamination weniger überrascht als beispielsweise Qualitätsanalytiker, da die Bildung der Nitrosamine auf der Hand lag.

Die internationalen Arzneibücher konzentrieren ihre Analytik auf Lösungsmittel und verwandte Substanzen. Diese Vorgehensweise berücksichtigt Nebenreaktionen von Lösungsmitteln und Reagenzien sowie deren jeweilige Verunreinigungen oder Zersetzungsprodukte fast gar nicht. So kann zum Beispiel Aceton unter bestimmten Reaktionsbedingungen zu Mesityloxid oder Acetonitril zu Acetamid reagieren, die dann weitere Reaktionen eingehen (20). Solche Gefahren müssen mehr in die Risikobewertungen und damit in das Verunreinigungsprofil Eingang finden. Zudem muss man über eine zusätzliche »ungezielte«, im Fachjargon »untargeted« genannte Reinheitsanalytik nachdenken, die mit den heute zur Verfügung stehenden HPLC/MS-Methoden machbar ist. Solche Konsequenzen aus dem »Valsartan-Skandal« reichen viel weiter als die Begrenzung von Nitrosaminen in Arzneistoffen und Arzneimitteln.