Viel mehr als eine molekulare Schere

Seit der ersten Demonstration von CRISPR-basiertem Gen-Editing hat sich das Feld in einem beispiellosen Tempo weiterentwickelt. Das Potenzial der Doppelstrangbruch-abhängigen Genom-Editoren der ersten Generation, das im Wesentlichen auf der Cas9-Nuklease basierte, wurde kontinuierlich verbessert. Diese Innovationen erhöhten nicht nur die Vielseitigkeit der Technologie, sondern verfeinerten auch die Präzision und minimierten unbeabsichtigte Folgen des Genom-Editings.

• Basen-Editing: Diese Methode nutzt eine modifizierte Cas9-Version. Darin ist die Nuklease inaktiviert und das modifizierte Cas9-Enzym ist an ein Nukleobasen-modifizierendes Enzym gekoppelt. Dies erlaubt es, gezielt einzelne Nukleotidbasen zu verändern, ohne Doppelstrangbrüche zu erzeugen. Cytosin-Basen-Editoren (CBE) ermöglichen die Umwandlung von C zu T, während Adenin-Basen-Editoren (ABE) A zu G konvertieren.
• Prime Editing: Beim klassischen CRISPR/Cas9-System schneidet das Cas9-Enzym beide DNA-Stränge. Beim Prime Editing wird hingegen eine modifizierte Version von Cas9 verwendet, die nur einen Strang der DNA schneidet. Man nennt dieses modifizierte Enzym auch Cas9-Nickase. Daran ist zusätzlich eine Reverse Transkriptase gekoppelt, die eine RNA-Vorlage in DNA umschreiben kann. Die RNA-Vorlage wird durch die »Prime Editing guide-RNA« (pegRNA) bereitgestellt, die zudem den CRISPR/Cas-Komplex an die richtige Stelle in der genomischen DNA dirigiert. So können gezielte Punktmutationen, Insertionen oder Deletionen im Genom erzeugt werden, die in der speziell konstruierten pegRNA bereits vorliegen und dann mithilfe der Reversen Transkriptase in DNA übersetzt und an der »genickten« DNA-Stelle eingebaut werden.
• Transkriptionsmodulation durch CRISPRi und CRISPRa: CRISPR-Technologien ermöglichen nicht nur die Genom-Editierung, sondern auch die gezielte Steuerung der Genexpression. CRISPRi verwendet komplett deaktivierte Cas9-Proteine und blockiert die Genexpression dadurch, dass das inaktive Cas9-Protein dort positioniert wird, wo eigentlich die RNA-Polymerase bindet. Dagegen wird durch CRISPRa-Strategien die Genexpression durch Aktivierung von Promotoren oder Chromatin-Modifikation gesteigert. Beide Methoden sind potenziell sehr leistungsfähig; ihr Einsatz ist jedoch derzeit noch durch beträchtliche Off-Target-Aktivitäten, das heißt durch unzureichende Genauigkeit, eingeschränkt.
• RNA-Editing: RNA-Editing nutzt Cas13-Proteine, die spezifisch auf Einzelstrang-RNA abzielen, um gezielte RNA-Modifikationen oder -Inaktivierungen zu erzielen. Diese transienten Änderungen bieten eine flexible Alternative zur Genom-Editierung, insbesondere für Erkrankungen, bei denen keine dauerhaften genetischen Veränderungen gewünscht sind. Durch die Fusion von Cas13 mit ADAR-Enzymen (Adenosindesaminase für RNA) können gezielte Basenumwandlungen in mRNA erreicht werden, zum Beispiel Adenin zu Inosin, das am Ribosom mit Cytosin basenpaart.
  Anwendung könnte das RNA-Editing beispielsweise zur Therapie der spinalen Muskelatrophie (SMA) finden, um eine Spleißmutation zu korrigieren, sodass die Produktion von funktionsfähigem SMN-Protein erhöht wird. Bei der Duchenne’schen Muskeldystrophie (DMD) könnte eine Korrektur von Nonsense-Mutationen zur Wiederherstellung eines funktionalen DMD-Transkripts eingesetzt werden. Zudem wird ein RNA-Editing zur Korrektur toxischer Mutationen im SOD1-Protein bei der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) oder im C9orf72-Protein bei der frontotemporalen Demenz erwogen. Ein Beispiel, bei dem die klinische Prüfung bereits begonnen hat, ist weiter unten beschrieben.