Ein Beitrag zum Wirkmechanismus von Efeu

Zubereitungen aus Efeublättern werden seit langem als Expektorantien eingesetzt. Den Inhaltsstoffen werden neben den expektorierenden auch sekretolytische und spasmolytische Effekte zugeschrieben. Immunhistochemische und biophysikalische Untersuchungen werfen ein neues Licht auf den möglichen Wirkmechanismus.

Die Behandlung von Krankheiten mit pflanzlichen Arzneimitteln ist eine der ältesten Therapieformen. Nach Einführung des Arzneimittelgesetzes 1978 wurde für jedes Arzneimittel eine Zulassung vorgeschrieben, deren Kernpunkt der Nachweis der pharmazeutischen Qualität, Wirksamkeit und Unbedenklichkeit des Arzneimittels ist. Dies gilt grundsätzlich auch für Phytopharmaka, beispielsweise Efeupräparate. Nach dem Arzneimittelgesetz stellt der pflanzliche Extrakt den Arzneistoff dar, der über eine genaue Beschreibung der Herstellung und Analytik definiert werden muss.

Efeu wird als Expektorans bei obstruktiven Atemwegserkrankungen mit produktivem Husten als Begleiterscheinung eingesetzt (1). Therapeutisch nutzt man sowohl seine sekretolytische als auch die bronchospasmolytische Wirkung. Klinische Studien mit Efeublättertrockenextrakt (Droge-Extrakt-Verhältnis, DEV 5-7,5:1) belegen eine deutliche Verbesserung wichtiger Lungenfunktionsparameter, gemessen mittels Spirometrie und Bodyplethysmographie, sowie eine Besserung des Wohlbefindens der Patienten (2-5). Im Vergleich zu Placebo war das Verum in einer Studie zum Beispiel hinsichtlich der Vitalkapazität, dem Residualvolumen und des Atemwegswiderstands klinisch und statistisch signifikant besser wirksam (6).

Neben der Wirksamkeit ist die sehr gute Verträglichkeit von Efeu-Zubereitungen durch toxikologische Untersuchungen sowie durch klinische Studien und Praxisdokumentationen belegt (7-11). So zeigte die retrospektive Auswertung der Behandlung von mehr als 52.000 Kindern mit einem Efeublättertrockenextrakt-haltigen Hustensaft (DEV 5-7,5:1), dass nur in 0,22 Prozent der Fälle unerwünschte Nebenwirkungen auftraten (12). Der Extrakt ist somit ein Expektorans mit nachgewiesener Wirksamkeit und guter Verträglichkeit, der im Rahmen einer rationalen Phytotherapie angewandt wird.

Als Wirkungsmechanismus des Efeublättertrockenextrakts wurde bisher eine Reizung der Magenschleimhaut mit reflektorischer Stimulation des Nervus vagus und nachfolgend vermehrter Sekretproduktion in den Becherzellen der Bronchialschleimhaut angenommen. Diese Theorie erklärt jedoch nicht den spasmolytischen Effekt der im Extrakt enthaltenen Saponine auf die Bronchialmuskulatur, der zum Beispiel durch eine dosisabhängige Hemmung einer durch PAF (Plättchen aktivierender Faktor) ausgelösten Bronchokonstriktion am Meerschweinchen gezeigt werden konnte (13). Dieser Befund lässt auf einen b2-mimetischen Effekt schließen, der die sekretolytische und bronchospasmolytische Wirkung des Extrakts plausibel erklären würde.

b2-Rezeptoren in der Lunge

An den Lungenbläschen (Alveolen) findet der Gasaustausch, das heißt die Aufnahme von Sauerstoff und Abgabe von Kohlendioxid, in der Lunge statt. Im Vergleich zu wässrigen Grenzschichten besitzt der Flüssigkeitsfilm der Alveolen eine deutlich geringere Oberflächenspannung, was eine optimale Belüftung der Lunge ermöglicht, den Gasaustausch erleichtert und den Schleimtransport verbessert. Daran ist maßgeblich der Oberflächenfaktor Surfactant beteiligt, der ständig in Alveolarepithelzellen vom Typ 2 gebildet, in kleine Behälter (lamelar bodies) verpackt und durch Exocytose an die Oberfläche gebracht wird. Bei der Exocytose verschmelzen die Biomembranen der lamelar bodies mit der Zellmembran, wobei Surfactant in den Flüssigkeitsfilm der Alveolarepithelzellen gelangt und dort die Oberflächenspannung herabsetzt.

Als Surfactant bezeichnet man ein Gemisch aus Phospholipiden und Surfactant-Proteinen A bis D. Seine Bildung wird unter anderem durch den Signalstoff cAMP (zyklisches Adenosinmonophosphat) in Gang gesetzt, der wiederum mit Hilfe eines Schlüsselenzyms, der Adenylatcyclase, hergestellt wird. Dieses Enzym wird durch Bindung des Neurotransmitters Adrenalin an den b2-adrenergen Rezeptor aktiviert (14).

Auch auf Zellen der glatten Bronchialmuskulatur findet man b2-adrenerge Rezeptoren. Deren Stimulation erhöht ebenfalls die cAMP-Konzentration, was eine Erniedrigung der intrazellulären Calcium-Konzentration durch erhöhte Ca2+-Speicherung im sarkoplasmatischen Retikulum und Ca2+-Ausstrom durch Calciumkanäle nach sich zieht. In der Folge wird die Myosinkinase durch eine cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) vermehrt phosphoryliert und verliert dadurch an Aktivität: Es kommt zur Relaxation der Bronchialmuskulatur.

Regulation der Signaltransduktion

Der b2-adrenerge Rezeptor (b2-R) gehört zur Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GCPR), ist strukturell durch sieben transmembranäre Domänen charakterisiert und innerhalb der Zellmembran in so genannten funktionalen Mikrodomänen (lipid raft, caveolae) lokalisiert. Nach Bindung von Adrenalin an den b2-Rezeptor lagert sich der G-Proteinkomplex, bestehend aus den Untereinheiten a, b und g, von der zytosolischen Seite aus an den b2-Rezeptor-Adrenalin-Komplex an. Nach Austausch von GDP (Guanosindiphosphat) gegen GTP (Guanosintriphosphat) an der a-Untereinheit spalten sich die b- und g-Untereinheit ab und die mit GTP beladene a-Untereinheit wandert innerhalb der Zellmembran zum Zielprotein, zum Beispiel der Adenylatcyclase (AC). Dort wird unter Verbrauch von GTP die AC aktiviert, die nun ihrerseits den sekundären Botenstoff cAMP synthetisiert.

Der b2-Rezeptor-Ligand-Komplex wird durch Phosphokinasen wie die Phosphokinase A (PKA) oder die b-adrenerge Rezeptorkinase 2 (bARK oder GRK2) phosphoryliert und durch Anlagerung von Zytoskelettbestandteilen wie dem Protein Arrestin desensitiviert. Durch die weitere Anlagerung von zytosolischen Proteinen wie AP-2 (assoziiertes Protein 2) und Clathrin kommt es zur Akkumulation und zum Trapping von b2-Rezeptor-Ligand-Komplexen und der Ausbildung von coated pits („Einstülpungen“) in der Membran.

Überschreitet die Signaltransduktion eine bestimmte Stärke, so wird der b2-Rezeptor-Adrenalin-Komplex (RL) nach Akkumulation in den coated pits in Form von frühen Endosomen mittels Endocytose in die Zelle aufgenommen (internalisiert). Auf diese Weise wird die Anzahl der membranständigen Rezeptoren reduziert und ein Überschießen des Signals verhindert. Der internalisierte Rezeptor wird bei starkem Signal, zum Beispiel auf Grund einer gleich bleibend hohen extrazellulären Ligandenkonzentration, im Zytoplasma abgebaut. Er kann aber auch unter Beteiligung von CURL (compartment of uncoupling of receptor and ligand) im Zuge eines Recyclings durch Einbau in die Zellmembran wiederverwertet werden, zum Beispiel um das extrazelluläre Signal nach Absinken der Ligandenkonzentration wieder zu verstärken. Auf diese Weise wird eine optimale Signaltransduktion gewährleistet, die für die Funktionalität der Zelle notwendig ist (15, 16).

► Dies bedeutet: Die Aktivierung des b2-Rezeptors löst eine Signalkaskade aus, bevor der Rezeptor internalisiert wird. Bleibt der Rezeptor in der Zellmembran, kann der Botenstoff Adrenalin dissoziieren und der Rezeptor erneut aktiviert werden.

Saponine des Efeuextraktes

Wichtige Bestandteile des Efeublätterextrakts sind Saponine vom Oleanoltyp, die im Wesentlichen durch das Aglykon Hederagenin, durch das Monodesmosid a-Hederin und das Bisdesmosid Hederacosid C vertreten werden. Der Extrakt wird auf Hederacosid C standardisiert. Die Europäische Arzneibuchkommission fordert in der Monographie für Efeublätter einen Mindestgehalt von 3,0 Prozent für Hederacosid C. Neben den genannten Saponinen kommen weitere Verbindungen dieser Substanzklasse, allerdings in nicht nennenswerten Mengen, im Efeuextrakt vor.

Für die Saponine konnte in Rezeptorbindungsstudien kein direkter b2-adrenerger Effekt nachgewiesen werden (17). Zur Erklärung der sekretolytischen und bronchospasmolytischen Wirkung des Extrakts wurde daher ein indirekter b2-mimetischer Effekt postuliert.

a-Hederin hemmt Internalisierung

Die Internalisierung von b2-adrenergen Rezeptoren konnte mittels Immunhistochemie an A549-Zellen (Alveolarzellen Typ 2) gezeigt werden. Hierfür wurden die Zellen zunächst mit einem Erstantikörper der Maus inkubiert, der spezifisch den b2-Rezeptor erkennt. Um den entstandenen b2-Rezeptor-Antikörper-Komplex sichtbar zu machen, wurde anschließend ein grün fluoreszenzmarkierter Zweitantikörper der Ziege zugegeben, der spezifisch gegen den Mausantikörper gerichtet war. Auf diese Weise ließen sich die b2-Rezeptoren im Fluoreszenzmikroskop als kleine grüne Spots eindeutig beobachten.

Nach weiterer Zugabe von 10 µM Terbutalin, einem spezifischen b2-Rezeptoragonisten, konnte bereits nach 20 Minuten eine intensive Internalisierung des b2-Rezeptors in Form von frühen Endosomen als grün fluoreszierende große Spots detektiert werden. Dagegen zeigten die unbehandelten Kontrollzellen keine wesentliche Internalisierung von b2-Rezeptoren.

Nach Vorinkubation mit 1 µM a-Hederin über 24 Stunden wurden die Zellen intensiv mit Inkubationspuffer gewaschen und das Efeusaponin entfernt. Die immunhistochemische Behandlung dieser Zellen zeigte nach Stimulation mit 10 µM Terbutalin bemerkenswerterweise keine nennenswerte Internalisierung von b2-Rezeptoren im Vergleich zur Positivkontrolle.

► a-Hederin hemmt demnach die intrazelluläre Aufnahme von b2-Rezeptoren unter stimulierenden Bedingungen und führt somit zu einer gesteigerten b2-adrenergen Ansprechbarkeit der Zelle (18, 19), da Adrenalin erneut an den Rezeptor an der Zelloberfläche binden kann.

Dieser Befund konnte mittels lasergestützter Zellscans und Aufzeichnung der resultierenden Fluoreszenzprofile an lebenden A549-Zellen bestätigt werden. Hierfür wurden die Zellen zunächst als Monolayer auf einem Deckglas immobilisiert. Danach ließ man das stark fokussierte Licht eines Argonlasers in Form eines ellipsoiden Lichtkegels in achsialer Richtung durch die Zelle wandern und zeichnete dabei simultan ein charakteristisches Zwei-Peak-Profil auf, das sich durch die Autofluoreszenz von anregbaren Molekülen, zum Beispiel bestimmten Proteinen, zu erkennen gab. Während die Autofluoreszenz der unteren Biomembran zum ersten Peak führte, zeigte das Zytoplasma eher eine intensitätsschwache Fluoreszenzspur, die jedoch in den zweiten Peak mündete, sobald der Lichtkegel die obere Biomembran traf.

Zur Detektion von b2-Rezeptoren mittels Zellscans diente das mit dem Fluoreszenzfarbstoff Alexa 532 markierte Noradrenalin (Alexa-NA), dessen spezifische Bindung an b2-Rezeptoren sowohl an A549-Zellen als auch an hippocampalen Neuronen gezeigt werden konnte (18, 19). Nach Inkubation der markierten Zellen mit 10 nM Alexa-NA zeigten sich nach 20 Minuten im Zytoplasma der lebenden Zellen einzelne Peaks von internalisierten b2-Rezeptor-Ligand-Komplexen, lokalisiert auf frühen Endosomen. Die Anzahl internalisierter b2-Rezeptoren ließ sich durch zusätzliche Inkubation der Zellen mit 1 µM Terbutalin im Kontrollversuch deutlich steigern.

Werden die Zellen aber über 24 Stunden mit 1 µM a-Hederin vorinkubiert und nach intensivem Auswaschen des Saponins anschließend mit 10 nM Alexa-NA und 1 µM Terbutalin behandelt, so findet man nach 20 Minuten im Gegensatz zur Positivkontrolle nur wenige Peaks im Zytoplasma. Das bedeutet: Selbst unter stark stimulierenden Bedingungen erfolgte keine nennenswerte Internalisierung von b2-Rezeptoren (18, 19). Mit Hederagenin und Hederacosid C war dieser Effekt nicht nachweisbar.

Bedeutung der Befunde

Mittels Immunhistochemie und biophysikalischer Verfahren konnte in vitro eine Hemmung der Internalisierung von b2-Rezeptoren durch a-Hederin – selbst unter stark stimulierenden Bedingungen – an Alveolarepithelzellen vom Typ 2 gezeigt werden. Durch diesen indirekten Einfluss auf die Regulation von ß2-Rezeptoren erhöht sich die ß2-adrenerge Ansprechbarkeit der Zellen. Die Stimulierung der Rezeptoren regt Typ-2-Alveolarepithelzellen an, vermehrt Surfactant zu bilden, welcher einen zähen Bronchialschleim verflüssigen kann. Dieser sekretolytische Effekt führt letztlich auch zur Hustendämpfung.

Bronchialmuskulaturzellen reduzieren unter b2-stimulierenden Bedingungen den intrazellulären Ca2+-Spiegel. Dies führt bei einer Bronchitis zur Relaxation der verkrampften Bronchialmuskulatur und erklärt plausibel den bronchospasmolytischen Effekt von Efeu.

Bemerkenswerterweise wurde eine Hemmung der Internalisierung von ß2-Rezeptoren nur für a-Hederin, jedoch nicht für Hederagenin oder Hederacosid C gefunden. Hederacosid C kann aber als Prodrug aufgefasst werden, weil es mit Hilfe von Esterasen, das heißt unter Abspaltung der über eine Esterfunktion gebundenen Zuckerkette, in vivo in a-Hederin umgewandelt wird. Eine Spaltung der glykosidischen Bindung zum Aglykon findet nicht statt. Resorptionsstudien zeigen, dass Hederacosid C im Plasma kaum mehr nachweisbar ist, weil es zu a-Hederin abgebaut wurde. Das Aglykon Hederagenin wird dagegen nicht gefunden.

► Die Forderung nach einem Mindestgehalt von 3,0 Prozent Hederacosid C ist somit sinnvoll, obgleich die Substanz selbst keinen Einfluss auf die regulatorischen Prozesse des b2-adrenergen Rezeptors hat.

In ersten Resorptionsstudien am Menschen wurde für a-Hederin eine Blutplasmakonzentration von 0,66 µM gefunden. In den vorgenommenen Tests reichte bereits eine Konzentration von 0,5 µM aus, um eine etwa 60-prozentige Hemmung der Rezeptorinternalisierung zu erreichen. Daraus kann man folgern, dass a-Hederin ausreichend bioverfügbar ist.

Die Befunde an Zellkulturen weisen einen möglichen Wirkmechanismus für den Efeublättertrockenextrakt auf molekularer und zellbiologischer Ebene plausibel nach. Damit untermauern sie die Bedeutung von Efeuextrakten als rationale Phytopharmaka zur Behandlung von obstruktiven Atemwegserkrankungen mit produktivem Husten als Begleiterscheinung.

Literatur

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Die Autoren

Frank Runkel absolvierte Pharmaziestudium und Promotion in Marburg und erwarb 1993 die Anerkennung als Fachapotheker für Pharmazeutische Analytik. Nach langjähriger Tätigkeit in der pharmazeutischen Industrie, unter anderem als Projektleiter für Validierung im Sterilbereich, GMP-Beauftragter, technischer Leiter und Herstellungsleiter sowie pharmazeutisch-technischer Direktor, folgte er 2002 einem Ruf auf die Professur Biopharmazeutische Technologie an der Fachhochschule Gießen-Friedberg.

Lars Prenner studierte Pharmazie an der Philipps-Universität Marburg. Nach dem praktischen Jahr in einer öffentlichen Apotheke erhielt er 2001 die Approbation als Apotheker. Seit 2002 arbeitet er als Doktorand im Arbeitskreis von Professor Dr. Hanns Häberlein.

Hanns Häberlein studierte Pharmazie in Marburg, wurde 1986 promoviert und erhielt 1991 die Anerkennung als Fachapotheker für Pharmazeutische Analytik. Zunächst als Wissenschaftlicher Angestellter am Institut für Klinische Biochemie am Fachbereich Humanmedizin der Universität Marburg tätig, erstellte er dann am Institut für Pharmazeutische Biologie seine Habilitationsschrift. 1994 folgte die Habilitation für das Fach Pharmazeutische Biologie und 2002 die Ernennung zum Professor für Zellbiologie und molekulare Wirkstoffforschung an der Medizinischen Fakultät der Universität Bonn.

Für die Verfasser:
Professor Dr. Hanns Häberlein
Physiologische Chemie
Rheinische-Friedrich-Wilhelm-Universität
Nussallee 11
53115 Bonn
haeberlein@institut.physiochem.uni-bonn.de

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