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Medizin-Nobelpreis

Sieg durch Knock-out

15.10.2007
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Medizin-Nobelpreis

Sieg durch Knock-out

Von Christina Hohmann

 

Den Nobelpreis für Medizin teilen sich in diesem Jahr die US-Amerikaner Sir Martin Evans und Mario Capecchi sowie der Brite Oliver Smithies. Sie entwickelten eine Methode, im Genom von Mäusen einzelne Gene gezielt auszuschalten: die sogenannte Knock-out-Technologie.

 

In fast jeder Ausgabe der Pharmazeutischen Zeitung tauchen sie auf: die Knock-out-Mäuse. Sie dienen als Modelltiere für Erkrankungen wie Diabetes, Multiple Sklerose oder Krebs. Sie helfen, die Pathologie zu erkunden oder neue Wirkstoffe zu testen. Zudem verwenden sie Genetiker, um die Funktion von Genen zu untersuchen. Doch trotz der Beliebtheit der Mäuse ist das Verfahren, das dahinter steht, kaum bekannt. Mit der Gene-Targeting-Technologie lassen sich einzelne Gene im Erbgut von Säugetieren gezielt manipulieren und die Veränderungen so verankern, dass sie von Generation zu Generation weitervererbt werden.

 

Entwickelt haben das Verfahren die drei Preisträger in den 1980er-Jahren. Sie schufen damit eine der wichtigsten Methoden der Biomedizin, die mittlerweile alle Bereiche der Forschung durchdrungen hat, schreibt das Nobelpreis-Komitee in seiner Begründung zur Preisvergabe. Fast die Hälfte der 22.000 Gene des Mäuseerbguts wurden mit dieser Technik bereits untersucht. Etwa 500 solcher modifizierten Mäusestämme dienen als Modelle für Erkrankungen beim Menschen.

 

Austausch von Genmaterial

 

Dieses heute so wichtige Verfahren beruht auf dem genetischen Prozess der homologen Rekombination. Dieser dient der Durchmischung des Erbguts. Zwischen den beiden Chromosomen eines Chromosomenpaares können DNA-Fragmente ausgetauscht werden. Dabei lagern sich ähnliche Sequenzen aneinander, ein Fragment wird in beiden Chromosomen ausgeschnitten und im jeweils anderen wieder eingefügt, ohne dass ein einziger Nucleotid verloren geht oder hinzukommt. Diese homologe Rekombination war schon seit mehr als 50 Jahren bekannt. Capecchi und Smithies hatten unabhängig voneinander die Idee, dass sich durch diesen Prozess das Erbgut von Säugetieren verändern ließe. Wenn die Sequenz eines Gens bekannt ist, lässt sich eine veränderte Form davon künstlich herstellen. In Zellen eingeschleust, wird dieses Fragment dann über homologe Rekombination ins Erbgut eingebaut, während die ursprüngliche Version herausgeschnitten wird. Genau dies konnte Capecchi demonstrieren: Er reparierte auf diese Weise fehlerhafte Gene im Erbgut von Mäusen. Smithies entdeckte zudem, dass sich über diese Methode alle Gene unabhängig von ihrer Aktivität verändern lassen.

 

Doch über dieses Gene-Targeting ließ sich nur das Genom von Einzelzellen manipulieren. Die Forscher wollten aber genmodifizierte Tiere schaffen. Sie mussten also die Keimbahn der Tiere erreichen. Die Idee hierfür lieferte Evans, der in seinem Labor an einem ganz anderen Projekt arbeitete: Er entnahm aus frühen Embryostadien, sogenannten Blastozysten, Zellen und züchtete diese in Kultur. Somit erhielt er als Erster embryonale Stammzellen. Wenn er diese Zellen in Blastozysten von anderen Mäusestämmen injizierte, entstanden Mosaikembryonen, die sich zu Mosaikmäusen entwickelten. In der Keimbahn mancher Tiere waren dann Gene aus den Stammzellen vorhanden.

 

Zwei Ideen kommen zusammen

 

1986 standen also alle Methoden bereit, eine genmodifizierte Maus zu erzeugen: Durch homologe Rekombination ließ sich das Erbgut verändern und die embryonalen Stammzellen schleusten die Veränderungen in die Keimbahn. Jetzt mussten die beiden Ansätze noch kombiniert werden.

 

Im Ganzen läuft der Knock-out-Prozess wie folgt ab: Aus Blastozysten eines Mäusestamms werden embryonale Stammzellen gewonnen und in Kultur vermehrt. In diese Zellen wird die fehlerhafte Kopie des zu untersuchenden Gens mithilfe eines Vektors eingeführt. Durch homologe Rekombination wird die defekte Kopie eingebaut, während die korrekte Kopie herausgeschnitten wird. Das Gen ist somit inaktiviert. Auf diese Weise manipulierte Stammzellen werden ausgewählt und vermehrt. Die Stammzellen werden in die Blastozyste eines anderen Mäusestamms (am besten mit einer anderen Fellfarbe) injiziert, wo sie sich in die innere Zellmasse einlagern und somit einen Mosaikembryo bilden. Diese werden in eine Leihmutter implantiert und von dieser ausgetragen. Mosaiktiere sind an ihrem zweifarbigem Fell zu erkennen. Durch Kreuzung der gemischtzelligen Tiere mit Wildtypmäusen lassen sich hetrozygote Knock-out-Mäuse herausfiltern. Durch Kreuzung dieser Tiere entstehen homozygote Knock-out-Mäuse, bei denen in allen Zellen des Körpers beide Kopien des Zielgens ausgeschaltet (ausgeknockt) sind. Diese Veränderung ist stabil und wird an alle Nachkommen weitervererbt.

 

Für ihre ersten Experimente wählten die Forscher das leicht zu identifizierende hprt-Gen aus. Es ist an der Entstehung einer schweren Erbkrankheit, dem Lesch-Nyhan-Syndrom, beteiligt. 1989 erschien dann der erste Bericht eines erfolgreichen Gen-Knock-outs bei Mäusen. Seither ist die Zahl der modifizierten Mäusestämme deutlich angestiegen. Fast jeder Aspekt der Physiologie kann durch Gene-Targeting untersucht werden. Nach der Preisverleihung sagte Smithies gegenüber dem Fachjournal »Nature«, besonders freue es ihn, beim Aufschlagen eines Journals so viele Publikationen zu finden, die auf Knock-out-Mäusen basieren. »Es ist ziemlich deutlich, dass die Homologe-Rekombinations-Methode stark zum Verständnis des Genoms beigetragen hat«, sagte Smithies. Von Genen könne man zwar die Sequenz kennen, doch erst durch das Ausschalten ließe sich die Funktion ermitteln.

 

Das Gene-Targeting hat es beispielsweise ermöglicht, die Rolle Hunderter Gene der Embryonalentwicklung zu klären. So entdeckte Capecchi verschiedene Gene, die den Bauplan von Säugetieren festlegen und an der Organentwicklung beteiligt sind.

 

Gerade bei der Untersuchung der Embryonalentwicklung war eine Weiterentwicklung der Methode hilfreich. Der deutsche Gentiker Klaus Rajewsky hat das Gene-Targeting so verändert, dass die übertragenen Gene nur für bestimmte Zeit oder in bestimmten Geweben aktiv sind. Dies ist wichtig, da etwa 15 Prozent aller Gene eine wichtige Rolle in der Embryonalentwicklung spielen - und die modifizierten Tiere nicht bis zur Geburt überleben würden. Da einige Gene erst spät im Leben an der Entstehung von Erkrankungen beteiligt sind, ist es hilfreich, die Zielgene zu jeder gewünschten Zeit an- und abschalten zu können. Gerade diese Weiterentwicklung hat den Wert der Methode für Forscher noch weiter gesteigert. Der Preisträger Evans ist sicher: »Die Bedeutung der Knock-out-Technik für die Erforschung der Genfunktionen und der Nutzen für die Menschheit werden noch viele Jahre weiter zunehmen.«

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