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CRISPR-Cas9

Gene ausschalten oder ersetzen

10.02.2016  09:29 Uhr

Von Annette Mende / Das CRISPR-Cas9-Verfahren ermöglicht Eingriffe in das Genom in einer vorher nie dagewesenen Präzision. In der Fachwelt ist es schon seit einigen Jahren sehr angesagt und wird breit eingesetzt. Die Öffentlichkeit wurde kürzlich darauf aufmerksam, als Großbritannien die Anwendung der Methode auf menschliche Embryonen genehmigte.

CRISPR-Cas-Systeme kommen natürlicherweise in Bakterien vor, bei denen sie einen Teil des adaptiven Immunsystems bilden. Die Bakterienzelle kann damit Abschnitte in ihrer DNA erkennen, die aus fremden Quellen stammen – etwa von Viren oder Plasmiden –, und gezielt herausschneiden. Die übliche Umschreibung des CRISPR-Cas9-Verfahrens als Genschere trifft es also sehr gut.

CRISPR sind charakteristische Gensequenzen im Bakterien-Genom, die erstmals Ende der 1980er-Jahre von japanischen Forschern beschrieben wurden. Es handelt sich um palindromische Sequenzen, die auf beiden DNA-Strängen in beiden Richtungen dieselbe Sequenz besitzen. Diese wiederholen sich in einem Cluster mehrfach, regelmäßig unterbrochen von kurzen DNA-Abschnitten (Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats). Ihre Funktion war zunächst unklar, man vermutete jedoch früh einen Zusammenhang mit der DNA-Reparatur oder Genregulation.

 

Fremd-DNA aus Viren oder Plasmiden

 

2005 fanden mehrere Arbeitsgruppen heraus, dass viele Spacer-Sequenzen innerhalb der CRISPR aus Plasmiden oder Viren stammten. Gleichzeitig stellte man fest, dass cas (CRISPR-associated)-Gene für Helikasen und Nukleasen codieren, also Enzyme, die die DNA-Doppelhelix auflösen beziehungsweise Nukleinsäuren abbauen. Heute weiß man, dass die Bakterien fremde DNA zum Beispiel von Viren in die CRISPR-Region einbauen und diese dann ablesen. Die so entstandene CRISPR-abhängige RNA (crRNA) bildet mit Cas- Proteinen einen Komplex. Die crRNA dient dabei dazu, das Genom auf die fremden, im CRISPR enthaltenen Gensequenzen zu scannen und Cas-Prote­ine an die entsprechende Stelle zu dirigieren, wo diese dann die Fremd-DNA beseitigen.

 

Eines dieser Cas-Proteine, Cas9, führt zu Doppelstrangbrüchen. Der entscheidende Schritt in der Entwicklung dieses Proteins zur Universal-Genschere war die Erkenntnis, dass man die crRNA durch eine snthetisch hergestellte Führer-RNA (guide RNA, gRNA) austauschen kann. Damit lässt sich das Cas-Protein nahezu an jede beliebige DNA-Stelle locken. 20 Nukleotide am 5'-Ende der gRNA erkennen dabei über Watson-Crick-Paarung die entsprechende DNA-Sequenz, Cas9 wird am 3'-Ende gebunden. Eigentlich spielt CRISPR in diesem Fall keine Rolle mehr, denn die Genschere wird ja nicht von einer crRNA, sondern von der gRNA angeleitet. Die Bezeichnung CRISPR-Cas9 für das entsprechende Verfahren hat sich jedoch etabliert und wird daher sowohl in der Fachliteratur als auch in den Publikumsmedien weiter verwendet.

 

Zu einem Schnitt kommt es allerdings nur dann, wenn in der unmittelbaren Nachbarschaft ein sogenanntes Protospacer Adjacent Motif (PAM) liegt. PAM dienen Cas9 als zusätzliche Marker für die Identifizierung von Fremd-DNA; ist kein PAM vorhanden, schneidet Cas9 auch dann nicht, wenn alle 20 Nukleotide der gRNA mit der Ziel-DNA zusammenpassen. Das soll verhindern, dass es an unerwünschten Stellen zu DNA-Brüchen kommt. Da PAM aber lediglich drei Basen lang sind und sehr häufig im Genom vorkommen – im Schnitt alle 40 Basen –, findet Cas9 fast überall eine Sequenz zum Schneiden.

Nachdem Cas9 die DNA zerschnitten hat, setzen Reparaturmechanismen ein, etwa die nicht homologe Endverknüpfung oder die homologe Rekombination. Diese können den Schaden jedoch nicht in allen Fällen beheben, sodass das betroffene Gen als Folge der Cas9-Manipulation meistens abgeschaltet bleibt. Das ist natürlich auch der Fall, wenn das Gen mittels zweier gRNA, die unmittelbar vor und hinter dem Locus andocken, komplett ausgeschnitten wird. Somit dient das Verfahren hauptsächlich dem Ausschalten von Genen.

 

In der Grundlagenforschung lassen sich damit wichtige Erkenntnisse über die Funktion einzelner Gene gewinnen. Das haben auch Forscher des Londoner Francis-Crick-Instituts vor, die kürzlich von der zuständigen britischen Behörde die Genehmigung erhielten, das CRISPR-Cas9-Verfahren an Embryonen anzuwenden. Die Gruppe um Dr. Kathy Niakan will Gene stilllegen, die in den ersten Tagen nach der Befruchtung aktiv sind, um deren Funktion zu klären. Sie erhofft sich so neue Erkenntnisse, etwa um die Behandlung von Infertilität zu verbessern. Die Embryonen stammen aus In-vitro-Fertilisationen, wo sie nicht benötigt wurden, und werden nach sieben Tagen zerstört, wenn sie das Blastocysten-Stadium erreichen und bis zu 256 Zellen umfassen.

 

Hat Cas9 ein Gen ausgeschnitten, lässt sich an dieser Stelle auch ein anderes einfügen. Dazu muss der erwünschte Genschnipsel über eine winzige Pipette in den Zellkern injiziert werden. Passt er, wird er eingebaut. Auf diese Weise können krankmachende Gene durch gesunde ersetzt werden – oder anders herum. So schleusen etwa Krebsforscher mittels CRISPR-Cas9 bestimmte Risikogene ins Genom von Versuchs­tieren ein, um deren Rolle bei der Krebsentstehung zu untersuchen.

 

Präzise und billig

 

Da das CRISPR-Cas9-Verfahren so präzise, einfach und viel billiger ist als bisher verfügbare vergleichbare Methoden, kann man es auch im großen Stil anwenden. So ermöglicht das gezielte Ausschalten einzelner Gene eine systematische Erfassung deren Funktion, und zwar in einem genomweiten Ansatz. Auf diese Weise sollen neue Angriffspunkte für Arzneistoffe identifiziert werden, so die Hoffnung. Auch für die Agrikultur ist CRISPR-Cas9 interessant, denn mit der Methode lassen sich etwa Krankheits- und Schädlings-Resistenzen oder auch andere erwünschte Merkmale sehr viel einfacher und schneller in das Genom von Pflanzen integrieren als bisher. /

 

Quelle:

 

Doudna, J. A., Charpentier, E.: Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. »Science«, November 2014 (DOI: 10.1126/science.1258096)

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