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Neue Wirkstoffe aus Myxobakterien

Wie Mikroorganismen den Krebs bekämpfen helfen

10.12.2007
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Neue Wirkstoffe aus

Wie Mikroorganismen den Krebs bekämpfen helfen

Von Bettina Frank und Rolf Müller

 

Aus Mikroorganismen isolierte Wirkstoffe sind wichtige Therapeutika und finden bei vielen verschiedenen Krankheitsbildern Einsatz. Besonders Bodenbakterien sind eine reiche Quelle für solche Substanzen. An der Universität des Saarlandes arbeitet ein Team aus Pharmazeuten, Chemikern und Biologen daran, das große biosynthetische Potenzial von Myxobakterien für die medizinische Chemie zu erschließen.

 

Naturstoffe waren nicht nur die ersten Pharmaka, die therapeutisch eingesetzt wurden, sie spielen auch heute noch eine überaus wichtige Rolle in der Arzneimitteltherapie. Rund die Hälfte der heute eingesetzten Wirksubstanzen sind Naturstoffe oder basieren auf Naturstoffderivaten (1). Das Wirkspektrum der Substanzen ist dabei vielfältig, sie werden als Zytostatika eingesetzt wie Paclitaxel, als Immunsupressiva wie Ciclosporin, als Cholesterolsenker wie Lovastatin, bei Malaria wie Artemisin oder bei systemischen Pilzinfektionen wie Amphotericin. Auch die ersten Antibiotika wurden in den Dreißiger und Vierziger Jahren des letzten Jahrhunderts aus Mikroorganismen isoliert. Erst seitdem es Verbindungen wie Penicillin und Streptomycin gibt, lassen sich bakterielle Infektionen effektiv bekämpfen und Krankheiten wie bakteriell verursachte Lungenentzündungen, Wundinfektionen oder Scharlach haben heute ihren Schrecken weitestgehend verloren. In gleichem Maße, wie neue Antibiotika entwickelt und eingesetzt werden, wachsen allerdings auch Bakterien heran, die gegen die neuen Verbindungen Resistenzen zeigen.

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Speziell im Fall der antibiotisch wirkenden Therapeutika ist deshalb die Suche nach potenten Alternativen ein Prozess, der niemals abgeschlossen sein wird. Im Reich der Mikroorganismen hat die Natur bereits reichlich Entwicklungsarbeit im Bereich der Antibiotika geleistet: Viele Einzeller produzieren Verbindungen, die um Lebensraum konkurrierende Organismen in ihrem Wachstum hemmen oder sogar abtöten können. Weltweit haben es sich Naturstoffforscher zur Aufgabe gemacht, dieses chemische Waffenarsenal der Mikroorganismen zu ergründen und auf eine mögliche therapeutische Anwendung hin zu untersuchen. Besonders Bodenbakterien haben sich dabei als eine reiche Quelle an pharmazeutisch interessanten Verbindungen erwiesen. Die meisten der in dieser Hinsicht gut charakterisierten Arten gehören zu den Aktinomyceten, wie der Erythromycin-Produzent Saccharopolyspora erythraea oder der Streptomycin-Produzent Streptomyces griseus. Hier ist allerdings inzwischen aufgrund intensiver Studien die Wiederfindungsrate bereits bekannter Verbindungen sehr hoch. Seit einigen Jahren sind deshalb andere Bakterien verstärkt in den Fokus der Naturstoffforschung geraten, die aufgrund der aufwendigen und anspruchsvollen Kultivierung vorher wenig beachtet wurden: die Myxobakterien (2).

 

Wirkstoffproduzenten aus Erdproben

 

Myxobakterien kommen natürlicherweise in Erde, Kompost und auf Tierdung vor, sie sind nicht pathogen und weltweit verbreitet. Der typische Geruch nach frischer Erde ist auf die Verbindung Geosmin zurückzuführen, die von ihnen und auch anderen Bodenbakterien produziert wird. Myxobakterien wachsen sehr langsam, je nach Art teilen sie sich selbst unter optimalen Bedingungen nur alle 6 bis 16 Stunden und können hinsichtlich dieser Eigenschaft mit dem Standard-Laborbakterium Escherichia coli, welches sich alle 20 bis 30 Minuten teilen kann, nicht mithalten. Dafür bestechen sie durch eine Reihe interessanter Eigenschaften wie einem ausgeprägten sozialen Verhalten. Auf festen Nährböden können die Kulturen schwärmen und bilden typische Wellen- und Kranzmuster. Die einzelnen Zellen bewegen sich dabei erstaunlicherweise in einem geordneten sozialen Gefüge. Wie die dafür notwendige Kommunikation zwischen ihnen gewährleistet wird, ist noch nicht ausreichend geklärt. Unter Nährstoffmangelbedingungen können die Bakterien Fruchtkörper bilden. Zur Herstellung dieser Strukturen schließen sich mehrere tausend Zellen zusammen und einige wenige differenzieren sich schließlich zu hitze- und trockenheitsresistenten Myxosporen. Wenn wieder günstigere Umweltbedingungen vorhanden sind, können diese auskeimen und neue Populationen begründen. Die Fruchtkörper werden auch zur Klassifizierung der einzelnen Arten herangezogen, sie können sehr aufwendige, baumartige Strukturen annehmen, aber auch relativ simpel und klumpig ausfallen. Eine weitere besondere Eigenschaft ist die enorme Größe der Erbinformation dieser Bakterien. Unter Federführung der Saarbrücker Arbeitsgruppe wurde kürzlich das Genom des Modellstammes Sorangium cellulosum So ce56 sequenziert, welches aus rund 13 Millionen Basenpaaren besteht und somit das bisher größte bekannte bakterielle Genom überhaupt darstellt (3). Auch das Genom von Myxococcus xanthus DK1622, einem weiteren Modellstamm, an dem vor allem die Zell-Zell-Kommunikation untersucht wird, ist mit rund neun Millionen Basenpaaren noch sehr groß.

 

Myxobakterien produzieren nicht nur die leicht flüchtige Verbindung Geosmin, sondern auch eine Vielzahl anderer Substanzen. Am Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung (HZI) in Braunschweig (ehemals Gesellschaft für Biotechnologische Forschung) wurden in den letzten 25 Jahren über 6000 Stämme dieser Bakterien untersucht und dabei rund 100 bis dahin unbekannte Strukturen isoliert und charakterisiert (4). Zählt man die ebenfalls identifizierten Strukturderivate dieser Verbindungen dazu, so sind es über 500 neue Substanzen. Viele dieser Verbindungen weisen eine biologische Wirkung auf. Das Spektrum der Wirkungen ist dabei vielfältig, einige Substanzen hemmen das Wachstum von Pilzen oder anderen Bakterien und sind damit potenzielle neue Fungizide oder Antibiotika. Besonders viele Verbindungen wirken, auf unterschiedliche Weise, auf Zellen höherer Organismen. Substanzen, die auf das Tubulingerüst eukaryontischer Zellen wirken, sind interessante Kandidaten für den Einsatz als Zytostatika. Das Tubulingerüst spielt eine wichtige Rolle bei der Zellteilung, und besonders unkontrolliert und schnell teilende Krebszellen sind von einer Wirkung auf diese Zellstruktur betroffen. Tubulysin und Epothilon sind Beispiele myxobakterieller Verbindungen, die mit dem Tubulingerüst eukaryontischer Zellen interagieren. Tubulysin fördert den Abbau der Mikrotubuli, Epothilon hingegen bewirkt eine Stabilisierung dieser natürlicherweise dynamischen Tubulin-Strukturen. Der mögliche Einsatz von Tubulysin in der Krebstherapie wird zur Zeit in präklinischen Studien geprüft. Epothilon aus S. cellulosum wurde in den letzten Jahren von Bristol-Meyers Squibb in einer Kooperation mit dem HZI entwickelt und in ausgiebigen klinischen Prüfungen als Brustkrebstherapeutikum getestet. Seit Kurzem sind alle Hürden auf dem Weg zum pharmazeutischen Wirkstoff genommen: die Zulassung für das Derivat Ixabepilone (Bristol-Meyers Squibb) ist vor wenigen Wochen in den USA erfolgt, in Deutschland ist dieser myxobakterielle Naturstoff voraussichtlich ab 2008 für die Therapie verfügbar. Die Besonderheit an Epothilon ist, dass es auf gleiche Weise wirkt wie der bisherige Goldstandard Paclitaxel (Taxol®), aber auch gegen Paclitaxel-resistente Zellen aktiv ist und damit zukünftig auch solche Tumore erfolgreich bekämpft werden können, die auf Paclitaxel nicht ansprechen (5). Zudem besitzen die Epothilone als bakterielle Wirkstoffe gegenüber dem aus Eiben-Arten gewonnenen Paclitaxel den herausragenden Vorteil, dass sie fermentativ herstellbar sind.

 

Biosynthese schlägt chemische Synthese

 

Bei den myxobakteriellen Verbindungen handelt es sich, wie häufig bei Naturstoffen, um sehr komplexe Verbindungen. Diese Strukturen sind auf synthetischen Wegen nur unter großem Aufwand oder gar nicht herzustellen. Besonders die Größe der Verbindungen und die komplizierte stereochemische Anordnung einzelner Molekülgruppen stellen dabei für die Synthese-Chemiker im Labor eine große Herausforderung dar. Um diese Substanzen oder Derivate davon als Wirkstoffe einsetzen zu können, werden die Naturstoffe deshalb häufig nach Fermentation aus den bakteriellen Produzenten gewonnen. Diese haben ihre ganz eigene »Biosynthesestrategie,« die zielgerichtet und effizient zur Produktion der wirksamen Verbindungen führt.

 

Viele der oben angesprochenen Wirkstoffe werden an riesigen Multienzymkomplexen biosynthetisiert, welche die komplexen Verbindungen aus einfachen, kleinen Biosynthesebausteinen zusammenfügen (6). Den Polyketidsynthasen (PKS) dienen kurzkettige Carbonsäuren als Substrate, nicht-ribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) verwenden Aminosäuren als Bausteine. Auch Mischformen dieser beiden Biosynthesesysteme, welche einem ähnlichen Grundprinzip folgen, existieren. Die Multienzymkomplexe sind in Module unterteilt, welche jeweils den Einbau einer Biosyntheseeinheit in ein wachsendes Grundgerüst verantworten. Die Module wiederum bestehen aus Domänen, die die einzelnen Schritte beim Einbau der Biosyntheseeinheiten und eventuell weitere Modifizierungen übernehmen. Dieser geordnete Aufbau spiegelt sich auch in den Produkten wie der. Häufig können schon aus der Struktur der Verbindungen Rückschlüsse auf die Art und Organisation des verantwortlichen Biosynthesesystems gezogen werden. Ebenso häufig jedoch werden die Naturstoffforscher bei der Erkundung neuer Biosynthesewege durch biosynthetische »Extras« wie ungewöhnliche Modulzusammenstellungen oder bis dahin unbekannte katalytische Aktivitäten überrascht. Wenn die Grundgerüste der Verbindungen durch die Multienzymkomplexe fertig biosynthetisiert sind, werden oft noch zusätzliche Modifikationen vorgenommen. Diese sind in der Regel für die biologische Aktivität einer Verbindung sehr wichtig. Für die Einführung solcher Modifikationen steht den Bakterien ein ganzes Arsenal von enzymatischen Aktivitäten zu Verfügung, mit denen beispielsweise Oxidationen, Methylierungen oder das Anhängen von Zuckerresten katalysiert werden.

 

Von der Untersuchung der Biosynthesewege versprechen sich die Forscher nicht nur ein prinzipielles Verständnis für den Ablauf der Produktbildung, sondern auch das Aufzeigen von Möglichkeiten, gezielt in die Biosynthese einzugreifen. Einzelne Module oder Domänen können inaktiviert, ausgetauscht oder neu zusammengesetzt werden. Auch die weiter-modifizierenden Enzyme sind dankbarer Gegenstand von Manipulationen und können ebenfalls inaktiviert, mutiert oder ausgetauscht werden. Bisher konnte schon in mehreren Fällen durch die gezielte Manipulation der Biosynthesewege erreicht werden, dass die Bakterien gewünschte Strukturderivate interessanter Verbindungen produzieren.

 

Diese Methode birgt hohes Potenzial für die pharmazeutische Entwicklung der bakteriellen Naturstoffe. Denn damit eine biologisch aktive Substanz als Wirkstoff therapeutisch eingesetzt werden kann, ist oft noch eine Derivatisierung der Verbindung nötig. Durch die Modifizierung einzelner funktioneller Gruppen kann beispielsweise eine geringere Toxizität und/oder eine größere therapeutische Breite erreicht werden. Auch die Verbesserung der physikochemischen Eigenschaften einer Substanz kann das Ziel einer Derivatisierung sein, so kann die Erhöhung der Wasserlöslichkeit eine orale Anwendung in der Therapie ermöglichen. Die Derivate, die aus einer gezielten genetischen Manipulation der bakteriellen Biosynthesewege resultieren, können auf eine verbesserte biologische Aktivität hin getestet werden (7). Möglich ist so auch das gezielte Einführen von funktionellen Gruppen, welche als Angriffspunkte für die nachfolgende medizinalchemische Veränderung dienen.

 

Auch im Fall des zytostatisch wirkenden Epothilons führte die Inaktivierung eines der Biosyntheseenzyme dazu, dass der Stamm Sorangium cellulosum So ce90 fast ausschließlich ein pharmakologisch aktiveres Derivat produziert, welches nun auch für die Krebstherapie entwickelt werden kann (8).

 

Wie bakterielle Biosynthesewege untersucht werden können

 

Die Gene, welche die Biosyntheseenzyme einer bestimmten Verbindung kodieren, befinden sich in aller Regel in sehr enger Nachbarschaft auf dem Chromosom der Bakterien. Diese Zusammenschlüsse der biosynthetisch relevanten Gene werden als (Biosynthese) Gencluster bezeichnet. Die Tatsache, dass die biosynthetisch relevanten Gene für eine Verbindung als Gencluster vorliegen, erleichtert ihre Identifizierung und Analyse. Die meisten der bisher untersuchten Biosynthesegencluster wurden über aufwendige molekularbiologische Techniken in Genbänken von interessanten Naturstoff-Produzenten entdeckt. In den letzten Jahren ermöglicht die rasante Entwicklung der DNA-Sequenziertechnologien eine schnellere Herangehensweise: Ist das Genom eines Bakteriums vollständig sequenziert, können Biosynthesegencluster bequem am Rechner anhand von Ähnlichkeiten zu bereits bekannten Genen durch bioinformatische Methoden identifiziert werden. Für die funktionale Analyse der identifizierten Gene werden ebenfalls bioinformatische Methoden herangezogen. Die aufgrund dieser Ergebnisse aufgestellten Hypothesen werden dann durch molekularbiologische, biochemische und klassisch chemisch-analytische Methoden im Labor experimentell überprüft (9). Für die Myxobakterien sind die kürzlich publizierten Genomsequenzen von Myxococcus xanthus und Sorangium cellulosum (3) deshalb als Meilensteine für die weitere Entwicklung der Forschung anzusehen.

 

Steigerung der Produktausbeuten durch genetische Manipulation

 

Für Forscher, die sich mit bakteriellen Naturstoffen beschäftigen, ist nicht nur die mechanistische Betrachtung der Biosynthese an sich interessant. Auch die Art und Weise, mit der die Bakterien das Ausmaß der Produktion regulieren, wird untersucht. Wenn es gelingt, Einblick in die zelleigenen Kontrollmechanismen der Produktion zu erhalten, können beispielsweise negative Regulatoren gezielt ausgeschaltet und damit die Produktausbeuten der Fermentation verbessert werden (10). Klassischerweise wird die Ausbeutesteigerung durch die Entwicklung geeigneter Nährmedien und das Austesten verschiedener Wachstumsbedingungen erreicht, daneben spielt aber diese gezielte quantitative Manipulation der bakteriellen Stoffwechselwege durch genetische Methoden bei der Produktionsoptimierung eine immer größer werdende Rolle. Weiterhin wird daran gearbeitet, die komplette genetische Information ganzer Biosynthesewege in andere, schneller wachsende Bakterien zu bringen, um diese die Wirksubstanzen produzieren zu lassen. Damit kann im Idealfall der Fermentationsprozess verkürzt und die Ausbeute gesteigert werden. Auch die weitere Manipulation der Biosynthesewege, um gewünschte Strukturderivate zu erhalten, kann dadurch erleichtert werden. Bisher hat der Transfer der Biosynthesewege in andere Organismen allerdings erst in wenigen Fällen dazu geführt, dass tatsächlich eine Produktionssteigerung erreicht wurde. Im Fall des myxobakteriellen Naturstoffes Myxochromid konnte durch den Wechsel des Wirtsbakteriums die Ausbeute von 8 mg/l nach sieben Tagen Wachstum auf 40 mg/l nach zwei Tagen Wachstum gesteigert werden (11). Diese Ergebnisse motivieren, hier weiter in die Forschung zu investieren.

 

Bisher stehen vor allem Actinomyceten und insbesondere Streptomyceten im Blickpunkt der bakteriellen Naturstoffforschung. Am Institut für Pharmazeutische Biotechnologie der Universität des Saarlandes untersucht die Arbeitsgruppe um Rolf Müller die Wirkstoffbildung in Myxobakterien. Diese ebenso vielversprechenden wie anspruchsvollen Prokaryonten sind eine Spezialität der Saarbrücker Forscher, die ihre Arbeiten vor zehn Jahren an der Gesellschaft für Biotechnologische Forschung (jetzt Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung, HZI) in Braunschweig begannen und auch seit dem 2003 erfolgten Wechsel nach Saarbrücken weiterhin intensiv mit dem HZI kooperieren. Dabei kommt ihnen zugute, dass in ihrem Team Pharmazeuten, Chemiker, Biologen, Mikrobiologen, und Biotechnologen eng zusammenarbeiten und ein breites Methodenspektrum entwickeln und einsetzen. Diese multidisziplinäre Zusammensetzung erlaubt, dass am Institut eine große Bandbreite der bakteriellen Naturstoffforschung abgedeckt wird: von der Isolierung neuer myxobakterieller Produzenten und biologisch aktiven Substanzen über die Identifizierung und funktionale Analyse der Biosynthesewege bis hin zur chemischen und biologischen Charakterisierung der natürlichen und neu generierten Produkte. Das Beispiel Epothilon zeigt, dass Myxobakterien die Investition lohnen.

Literatur

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Für die Verfasser:

Dr. Bettina Frank

Pharmazeutische Biotechnologie

Universität des Saarlandes

Im Stadtwald

66123 Saarbrücken

Telefon (06 81) 30 26 46 3

b.frank(at)mx.uni-saarland.de

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