Längst keine Utopie mehr |
 | 09.11.2015 15:51 Uhr |
Von Philip Böhme, Johannes Dörner und Anja Ehrhardt / Gentherapie bedeutet die Korrektur von fehlerhafter Erbinformation innerhalb eines lebenden Organismus mit dem Ziel, Erkrankungen zu heilen. So futuristisch dieser Ansatz anmutet: Er ist bereits Realität. Europa ist Vorreiter bei der klinischen Implementierung des ersten auf dem Markt erhältlichen gentherapeutischen Arzneimittels: Glybera.
Als Gentherapie bezeichnet man Verfahren, bei denen Erkrankungen therapiert werden, indem Gene oder deren regulierende Elemente ergänzt, verändert oder direkt korrigiert oder ausgeschaltet werden. Meist sind es entschärfte Viren, die die neue Erbinformation in den erkrankten Organismus einbringen sollen.
Ein wunderbares, aber auch fehleranfälliges Gebilde
Foto: Fotolia/molekuul.be
Doch wie wird ein normalerweise pathogenes Virus zu einem Heilmittel? Und wie bringt man das Virus an sein Ziel und vermeidet dabei unerwünschte Effekte? Dies sind wichtige Fragen rund um die Gentherapie. Dass die Methode Zukunftspotenzial hat, zeigen die vielen gentherapeutischen Medikamente, die sich in Phase I bis III der klinischen Erprobung befinden (1–3). 2012 wurde mit Alipogen Tiparvovec (Glybera®) das erste Gentherapeutikum für den europäischen Markt – als Erstes in der westlichen Welt überhaupt – zugelassen (4). Bereits 2003 wurde Gendicine zur Behandlung von Tumoren auf dem chinesischen Markt zugelassen.
Kleine Fehler, fatale Folgen
Kleinste Webfehler in einem der mehr als 20 000 menschlichen Gene oder in den sie regulierenden Bereichen können verheerende Folgen haben. Diese Webfehler sind entweder von Geburt an vorhanden oder werden während des Lebens erworben. Jeden Tag entstehen im menschlichen Genom durch innere oder äußere Einflüsse (intrinsisch oder extrinsisch) fehlerhafte Kopien. Ob und wann daraus eine Krankheit entsteht, bleibt häufig im Dunkeln.
Führt eine Mutation in einem Gen zu einem krankhaft veränderten Protein, kann dies – wie bei vielen monogenetischen Erkrankungen – eine primär nicht heilbare Erkrankung auslösen. So führt eine Mutation in dem für CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) kodierenden Gen zur Mukoviszidose. Die Betroffenen haben trotz moderner symptomatischer Therapie nach wie vor eine deutlich reduzierte Lebenserwartung.
Eine logische Konsequenz stellen gentherapeutische Ansätze dar. Durch das Einbringen von therapeutischer DNA in eine Zielzellpopulation kann das verantwortliche Gen durch gesunde Kopien ergänzt oder direkt korrigiert werden. Für viele Erkrankungen, die heute nicht oder nur symptomatisch behandelbar sind, entstünde Hoffnung auf eine dauerhafte Heilung.
Erste Anfänge
Seit mehr als 50 Jahre arbeiten Forscher daran, Gene zu beeinflussen, um Erkrankungen zu therapieren. Als in den 1960er-Jahren erstmals gezeigt werden konnte, dass DNA von einer Zelle auf die andere übertragen werden kann, dauerte es nicht lange, bis an den Universitäten, vor allem in den USA, die Idee entstand, dies im Sinne einer Therapie zu nutzen (5, 6).
Wenig später gelang es erstmals, Zellen von Patienten mit dem Lesch-Nyhan-Syndrom, einer seltenen erblichen und mitunter fatalen Störung des Purinstoffwechsels, durch Einbringen fremder DNA phänotypisch in Zellkultur zu korrigieren. Anfang der Siebzigerjahre folgte das erste Treffen für Gentherapie bei der amerikanischen Gesundheitsbehörde NIH (National Institutes of Health) in Bethesda, Maryland (7). Hier bekräftigten die Wissenschaftler, dass die Fortentwicklung einer Gentherapie, die nicht die Keimbahn betrifft, im Sinn des medizinischen Fortschritts erstrebenswert erscheint.
Die Mukoviszidose gehört zu den monogenetisch bedingten Erkrankungen. Physio- und Atemtherapie gehören zum Leben der Erkrankten.
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Zu Beginn der 1980er-Jahre wurde in Los Angeles die erste Gentherapiestudie am Menschen durchgeführt. Cline und Kollegen hatten in vorklinischen Studien gezeigt, dass es möglich ist, murine Zellen auf verschiedene Weise zu verändern und diese in vivo in Mäusen wieder zu repopulieren. Ohne die Erlaubnis durch den Ethikrat ihrer Universität oder einer Behörde übertrugen sie eine intakte Kopie des Globin-Gens auf Patienten mit Thalassämie. Auch wenn der Versuch klinisch ineffizient war und von der wissenschaftlichen Gemeinschaft als zu früh und riskant abgelehnt wurde, markiert er doch den Startpunkt für zahlreiche Gentherapiestudien am Menschen – bis heute etwa 2000 (7).
Meilensteine auch für die Gentherapie waren die durch HIV induzierte Forschung an Retroviren und molekularbiologische Fortschritte, die es ermöglichten, DNA sequenzspezifisch zu verändern und nach Belieben wieder zusammenzufügen, sprich: zu klonieren. Man erkannte, dass bestimmte Viren ihre eigene DNA/RNA in fremde Zellen einschleusen. In Jahrmillionen evolutionärer Koexistenz haben diese Viren Mechanismen entwickelt, ihre Wirtszellen zu erkennen, in diese einzudringen und dort dauerhaft zu persistieren.
Diese Eigenschaft wollen Wissenschaftler nutzen, indem sie therapeutische DNA als Passagier in einem genveränderten Virus, dem Gentaxi, in Zellen einschleusen (siehe Kasten mit Grafik auf der nächsten Seite). Dabei ist zu bedenken, dass durch eine erwünschte oder unerwünschte Integration der therapeutischen DNA in die Chromosomen des Patienten die Ablesung der Gene verändert, Promotoren aktiviert/inaktiviert oder Proteine direkt geschädigt werden können.
Das verwendete Virus ist idealerweise nicht für den Menschen pathogen und kann sich in diesem auch nicht vermehren. Andernfalls muss es entschärft werden, um einer möglichen Pathogenität so weit wie möglich vorzubeugen. Dem Virus werden zur Vermehrung essenzielle genetische Elemente gentechnisch genommen und an deren Stelle ein therapeutisches Element eingesetzt. Die Vermehrung erfolgt dann in Zelllinien, in denen die fehlenden Elemente vorhanden sind, von dort aber nicht erneut in das Virus aufgenommen werden können.
Zwei Katastrophen
Mit einem derart veränderten Retrovirus erfolgte dann die erste gentherapeutische Studie zu Beginn der 1990er-Jahre. Ziel war die Behandlung von ADA-SCID (Adenosindesaminase Severe Combined Immunodeficiency). Bei dieser autosomal rezessiven Erkrankung entwickeln die betroffenen Kinder kein funktionsfähiges Immunsystem und sind früh von opportunistischen Infektionen betroffen, die potenziell tödlich verlaufen (8). Da das in dieser Studie verwendete Gentherapeutikum keine Toxizität zeigte und zu einem moderaten klinischen Erfolg führte, folgten weitere Studien, auch bei anderen Erkrankungen.
Der virale Gentherapievektor besteht aus der identischen Hülle wie das Wildtypvirus, unterscheidet sich jedoch in der enthaltenen DNA (links in Grafik 1). Das Wildtypvirus-Genom besteht aus Genom-flankierenden Sequenzen und einem Verpackungssignal (rot), das das Virusgenom in die Virushülle führt, sowie der genetischen Information für die viralen Proteine (gelb). Der Gentherapievektor enthält im Idealfall nur noch die Genom-flankierenden Sequenzen und das Verpackungssignal des Wildtypvirus in Kombination mit einem therapeutischen Gen (grün, links unten). Das Gen kann je nach Studie durch molekulare Klonierung auf DNA-Ebene ausgetauscht werden.
Für die Konstruktion des Gentherapievektors wird das Wildtypvirus- Genom aus der Proteinhülle isoliert. Anschließend wird dieses mittels molekularbiologischer Methoden so verändert, dass die Sequenzen, die für die viralen Proteine kodieren, entfernt werden und die therapeutische DNA eingefügt wird.
Die Herstellung des Gentherapievektors erfolgt in einer speziell hierfür hergestellten Zelllinie, zum Beispiel humane embryonale Nierenzellen oder andere geeignete Zelllinien (rechts in der Grafik). Ist die DNA- Sequenz für das Gentherapeutikum präsent, wird dieses Konstrukt in die Virushülle verpackt, wobei essenzielle virale Proteine zur Verfügung gestellt werden (gelb). Nach einem komplexen Reinigungsprozess steht das modifizierte Virus zur Anwendung am Patienten bereit.
In der Folge traten zwei Katastrophen ein, die die gentherapeutischen Forschungen fast gänzlich beendeten und um Jahre zurückwarfen. Im Jahr 1999 wurde dem erst 19-jährigen Jesse Gelsinger in einer Dosisfindungsstudie an der Universität von Pennsylvania die höchste Dosis eines adenoviralen Gentherapeutikums intrahepatisch verabreicht. Das Medikament kodiert für das bei Gelsinger defekte Enzym Ornithintranscarbamylase (OTC). Menschen mit OTC-Mangel leiden lebenslang an Symptomen, die aus dem akkumulierenden Harnstoff resultieren, aber sie sterben in der Regel nicht daran. Als einziger Patient der Studie reagierte Gelsinger auf das Gentherapeutikum nicht wie die Studienteilnehmer vor ihm mit einem leichten Temperaturanstieg und mild erhöhten Transaminasen, sondern mit einer komplexen systemischen Immunantwort. Trotz aller medizinischen Anstrengungen starb der Patient 96 Stunden nach Verabreichung des Gentherapeutikums (9).
Im Jahr 2002 wurden Ergebnisse veröffentlicht, die die Zweifel an der klinischen Eignung der Gentherapie weiter wachsen ließen. In einer europäischen Studie in Frankreich und England war der anfänglich erhebliche Erfolg bei der Behandlung von Kindern, die an X-SCID litten, nicht von Dauer. Dabei handelt es sich um eine Erkrankung, bei der Betroffene aufgrund eines Gendefekts ein nicht funktionsfähiges Immunsystem haben und somit anfällig für jegliche Art von Infektion sind. Mehrere Studienteilnehmer entwickelten zum fast gleichen Zeitpunkt Leukämie-ähnliche Erkrankungen, in deren Folge einige starben (10, 11). Es stellte sich heraus, dass das Virus vor einem Onkogen auf dem Chromosom integriert hatte. Durch seine starken Promotor- und Enhancer-Elemente konnte das Virus das Onkogen aktivieren, was eine klonale Expansion einzelner Zellen antrieb.
Dieses Verhalten von Gentherapievektoren wurde auch in anderen Studien festgestellt, die zum Teil in Deutschland stattfanden (12). Das Entschärfen der viralen Gentherapeutika war also nicht gelungen. Die Wissenschaftler mussten erst eine neue Generation von viralen Systemen erzeugen, um wieder Studien am Patienten starten zu können.
Grafik 2: Bei Gentherapiestudien unterscheidet man prinzipiell zwei Therapieschemata, die In-vivo-Therapie (links) und die Ex-vivo-Therapie (rechts), bei der Stammzellen entnommen, modifiziert und dem Patienten zurückinfudiert werden.
Ex vivo und in vivo
Dank moderner Gentherapieverfahren und Studienprotokolle wurden Sicherheitsstandards und Effizienzen in den letzten Jahren deutlich gesteigert. Dabei unterscheidet man auf Basis des Studienprotokolls zwei grundsätzlich verschiedene gentherapeutische Ansätze: die In-vivo- und die Ex-vivo- Therapie.
Die Forschung an und mit genetischem Material hat vor Jahrzehnten begonnen und eröffnet enorme Potenziale.
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Virale und nicht virale Therapeutika
Moderne Gentherapeutika lassen sich in zwei große Gruppen einteilen, basierend auf viralen und nicht viralen Systemen.
Nicht virale Systeme bauen in den meisten Fällen auf reiner DNA auf, die zum Beispiel in chemische Konjugate verpackt wird. Diese Konjugate stehen für die Therapie in vivo oder ex vivo zur Verfügung. Eine Herausforderung ist es, sicherzustellen, dass das Gentherapeutikum durch den Blutstrom zu den Zielzellen und in deren Zellkern gelangt – und nicht in andere Zellen. Für den Erhalt des nicht viralen Gentherapeutikums in den Zielzellen wurden in den letzten Jahren mehrere Systeme entwickelt, um Persistenz und Replikation der therapeutischen DNA entweder durch Integration in die Chromosomen oder extrachromosomale Stabilität sicherzustellen. Ein Gentherapiesystem, das nicht in das Hausgenom integriert und dieses damit auch nicht verändern kann, aber trotzdem bei der Zellteilung repliziert und an beide Tochterzellen weitergegeben wird, ist eins der großen Ziele der gentherapeutischen Forschung.
Diese Probleme stellen sich aufgrund ihres biologischen Verhaltens bei Viren nicht. Aber auch die viralen Systeme haben sich seit Beginn der ersten Gentherapiestudien maßgeblich verändert. Klinisch zurzeit am erfolgreichsten sind Lentiviren, zu denen auch HIV gehört und die wie alle Retroviren in die Chromosomen der Zellen stabil integrieren. Die krankheitsrelevanten Sequenzen im RNA-Virusgenom werden entfernt und durch benötigte DNA-Sequenzen ersetzt.
Die neuen Generationen von genveränderten Lentiviren haben etliche Vorteile. Anders als die sehr nah verwandten murinen Retroviren, die in klinischen Studien zur klonalen Expansion neigten, wirken sie nicht onkogen. Außerdem kann man sie in relativ hohen Konzentrationen herstellen und relativ leicht die viralen Oberflächenproteine austauschen; so entstehen sogenannte Vektor-Pseudotypen (13). Lentiviren können auch nicht teilende Zellen effizient infizieren.
Das Adeno- assoziierte Virus dient als Gentaxi.
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Nachteil dieser modernen Lentiviren: Sie eignen sich klinisch aufgrund ihres Infektionsverhaltens aktuell nur für die Ex-vivo-Therapie.
Ihr gentherapeutisches Pendant für die In-vivo-Therapie sind die DNA-basierten Adeno-assoziierten Viren (AAV). Dies sind sehr kleine und relativ simpel aufgebaute Viren, die aus nur wenigen Genen bestehen. In der Natur überleben sie nur in Koinfektion mit einem anderen Virus (Adenovirus, daher der Name), das wichtige Proteine für die Replikation zu Verfügung stellt. Das rekombinante AA-Virus, das in der Therapie eingesetzt wird, integriert nur in einer relativ geringen Frequenz in die Chromosomen, was die Therapie meist transient macht. Durch Zellteilungen verliert sich der therapeutische Effekt. Die Erzeugung von Pseudotypen ist wie bei Lentiviren möglich und die in der Produktion erreichten Konzentrationen sind ebenfalls hoch.
AAV erscheint nach aktuellem Stand sicher. In den Studien sind bis dato noch keine relevanten virusassoziierten Nebenwirkungen aufgetreten.
Auch beim ersten auf dem europäischen Markt für LDL-Defekte zugelassenen Gentherapeutikum Alipogen Tiparvovec (Glybera®) handelt sich um ein Adeno-assoziertes Virus. Das Medikament richtet sich an Erwachsene mit einer Lipoproteinlipase-Defizienz. Es handelt sich um eine angeborene Fettstoffwechselstörung, die sich als Multisystemerkrankung manifestiert. Glybera kodiert dabei für das defekte Enzym. Aufgrund der Neuartigkeit der Gentherapie und des komplizierten Kosten-Nutzen-Bewertungsverfahrens, an dem auch die europäische Zulassungsbehörde EMA beteiligt ist, steht der Beschluss des Gemeinsamen Bundesausschusses G-BA noch aus. Auch wenn die langfristigen Vorteile für die Patienten noch schwer abzuschätzen sind, konnte gezeigt werden, dass die Gentherapie in der Klinik, auch außerhalb von klinischen Studien, angekommen ist.
Die lentiviralen und AAV-basierten Gentherapeutika sind momentan die klinisch am weitesten entwickelten Systeme. Jedoch stehen die neueste Generation von Adenoviren und viele nicht virale Systeme vor dem Sprung in größere klinische Studien.
Erfolge in kleinen Studien
Eine Reihe von hoffnungsvollen klinischen Ergebnissen stammt aus Italien, von einer Gruppe um Luigi Naldini, der Pionierarbeit im Bereich der Lentiviren geleistet hat. Am Institut TIGET (Telethon institute for gene therapy) in Mailand ist es den Forschern gelungen, gleich zwei bisher unheilbare, fatal verlaufende pädiatrische Krankheiten mit lentiviraler Gentherapie erfolgreich zu behandeln.
Stammzellen sind wertvolles Ausgangsmaterial für eine Gentherapie.
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Die metachromatische Leukodystrophie ist eine Speicherkrankheit (Sphingolipidose), die durch Demyelisation und Degeneration des zentralen Nervensystems (ZNS) gekennzeichnet ist. Die Krankheit manifestiert sich bereits in der frühen Kindheit mit Ataxie, Sprachstörungen, Visusverlust und schlaffen Lähmungen. Patienten mit der juvenilen Form sterben meist relativ früh. Ursächlich ist eine Anreicherung toxischer Stoffwechselprodukte, die aufgrund eines Mangels an Arylsulfatase A nicht abgebaut werden können.
Aus der Beobachtung heraus, dass hämatopoetische Stammzellen mit korrigiertem Enzymdefekt in das ZNS einwandern und sich dort am Abbau der akkumulierten Substanzen beteiligen, entwickelte die Gruppe einen lentiviralen Therapieansatz. Dieser beinhaltete die Entnahme der hämatopoetischen Stammzellen (HSC), deren Infektion mit dem für das defekte Enzym kodierenden Lentivirus sowie die Reinfusion der veränderten HSC. Bei allen drei behandelten Kindern schritt die Erkrankung nicht weiter fort. Zudem zeigten die Kinder im Magnetresonanztomogramm (MRT) keinen Progress im Vergleich zu unbehandelten Patienten. Sie haben ihre ebenfalls erkrankten Geschwister mittlerweile überlebt (2).
Wenn es so einfach wäre...
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In einer weiteren Studie behandelte die Gruppe Kinder mit Wiskott-Aldrich-Syndrom. Dabei handelt es sich um eine Immundefizienz durch einen Defekt auf dem für das Wiskott-Aldrich-Protein (WASP) kodierenden Gen. Dadurch kommt es zu Thrombozytopenien und opportunistischen Infektionen. Auch hier bestand das Protokoll aus Entnahme und Reinfusion der korrigierten HSC und war erfolgreich. So konnten korrigierte ausdifferenzierte Lymphozyten im Blut nachgewiesen werden und es kam zu einer phänotypischen Korrektur der Erkrankung (1).
Die In-vivo-Gentherapie konnte in den letzten Jahren ebenfalls deutliche klinische Erfolge verbuchen. So wurden 2011 sechs Patienten, die unter schwerer Hämophilie B litten, intravenös mit einem AAV behandelt, der Faktor IX als therapeutisches Gen trug. Bei allen Patienten war nach sechs bis 16 Monaten ein therapeutisch relevanter Anstieg des korrigierten Faktors IX zu beobachten. Vier der sechs Patienten konnten sogar ihre Faktor-IX-Substitution beenden und hatten während der Dauer der Studie keine Blutungskomplikationen (3). Der Erfolg blieb weitere drei Jahre bestehen. Somit konnte die erfolgreiche Gentherapie hohe Behandlungskosten aufgrund der kostenintensiven Faktor-IX-Substitution langfristig reduzieren.
Ehrgeiziges Ziel: Korrektur in vivo
Doch moderne Gentherapieforschung versucht mittlerweile noch mehr als nur defekte Gene zu ersetzen. Gene Editing – Gene reparieren anstatt zu ersetzen – ist das Schlagwort auf den internationalen Meetings der letzten Jahre. Mit dieser Methode wollen Forscher defekte Gene in den Zellen mit speziellen Enzymen sequenzspezifisch verändern und Defekte in vivo korrigieren.
Beispielsweise können korrekte DNA-Sequenzen in den durch die Enzyme erzeugten Doppelstrangbruch mittels homologer Rekombination eingefügt werden. Außerdem kann die Translation von unerwünschten Proteinen in Zellen direkt und dauerhaft verhindert werden, indem man deren kodierende DNA zerschneidet. Ein Beispiel ist der HIV-Rezeptor CCR5. Der Knockout von CCR5, der keine bekannten relevanten Nebenwirkungen hat, soll die Aufnahme von HIV in die gentherapierten CD4+-Zellen vermindern (14).
Diese Ansätze markieren ein weiteres Kapitel der Gentherapie und befinden sich gerade auf dem Weg in die klinische Praxis. Fest steht: Die eine Gentherapie wird es nicht geben. Es wird eine Vielfalt von gentherapeutischen Verfahren entstehen, die für die zu behandelnde Erkrankung maßgeschneidert sein werden. /
Literatur
Philip Böhme studierte Ingenieurwissenschaften am Karlsruher Institut für Technologie (KIT) der Universität Karlsruhe. Seine Diplomarbeit fertigte er am dortigen Lehrstuhl für Molekulare Aufarbeitung von Bioprodukten an. Nach dem Diplomabschluss 2012 begann Böhme ein Medizinstudium an der Universität Witten-Herdecke. Im Rahmen seiner Doktorarbeit verbrachte er 2015 einen Forschungsaufenthalt an der Universität von Washington in Seattle/Washington, USA, und arbeitete dort an gentherapeutischen Verfahren.
Johannes Dörner studierte Humanmedizin in Mainz und Paris. Seit 2011 ist er als Assistenzarzt am Helios Klinikum Wuppertal tätig. Neben seiner klinischen Tätigkeit forscht er an neuen Virotherapeutika gegen Tumorerkrankungen. Böhme und Dörner sind Teilnehmer eines von der Universität Witten-Herdecke neu eingerichteten Programms zur Förderung von medizinischen, naturwissenschaftlichen und pharmazeutischen Nachwuchswissenschaftlern. Beide arbeiten in der Gruppe von Professor Dr. Anja Ehrhardt.
Anja Ehrhardtstudierte Biologie an den Universitäten Göttingen und Hamburg und wurde 1998 promoviert. Zehn Jahre später habilitierte sie sich im Fach Medizinische Virologie an der LMU München. Nach mehrjährigen Forschungsaufenthalten, unter anderem an der Stanford University, USA, leitete sie einen Sonderforschungsbereich am Department für Virologie an der LMU. Seit 2011 ist sie Direktorin des Instituts für Virologie und Mikrobiologie der Universität Witten-Herdecke. Ihre Arbeitsgruppe erforscht virologische Grundlagen der Gentherapeutika und arbeitet an der Herstellung von neuartigen Adenoviren. Ziel ist es, besonders große genetische Konstrukte in Zellen einzuschleusen, um damit den Ersatz defekter großer Gene zu ermöglichen.
Philip Böhme, Johannes Dörner und Professor Dr. Anja Ehrhardt
Institut für Virologie und Mikrobiologie
Zentrum für Biomedizinische Ausbildung und Forschung (ZBAF)
Universität Witten-Herdecke
Stockumerstraße 10
58448 Witten
