Sirane auf dem Vormarsch

Die Kürzel RNA oder RNS, Akronyme für »ribonucleic acid« oder »Ribonukleinsäure«, assoziieren die meisten wohl mit messenger RNA (mRNA) als Zwischenspeicher im Rahmen der Decodierung der in der DNA gespeicherten Information, mit transfer RNA (tRNA) als Transportmoleküle für Aminosäuren und Vermittler zwischen mRNA und Protein sowie mit ribosomaler RNA (rRNA) als Strukturelemente und Katalysatoren in den Ribosomen. Dass diese einfach gebauten Biomoleküle mit ihrem Ribose-Phosphat-Rückgrat und den vier Nukleobasen Uracil, Cytosin, Adenin und Guanin auch als Arzneimittel fungieren können, hatte man lange für unmöglich gehalten. Andererseits bietet dieses einfache Bauprinzip über die eindeutigen Komplementaritätsregeln für Nukleinsäuren ein Höchstmaß an Bindegenauigkeit bei einer Wirkstoff-Target-Wechselwirkung.

Jedoch hatte man etliche Vertreter der Molekülspezies RNA in den Zellen lange übersehen beziehungsweise deren Bedeutung und Funktion als »Vorlage« für Arzneistoffe nicht verstanden. Darunter finden sich auch die small interfering RNA (siRNA) – das sind synthetische Analoga der micro RNA (miRNA) –, die als »Sirane« heute eine eigene Gruppe sehr innovativer und potenter Wirkstoffe bilden. Allerdings entpuppen sich die scheinbar einfach gebauten doppelsträngigen RNA-Wirkstoffe bei näherem Hinsehen sowohl strukturell als auch mechanistisch als hochkomplex.

In den Zellen befinden sich jenseits der gut bekannten Vertreter noch viele weitere RNA-Moleküle, darunter die small nuclear RNA (snRNA), die small nucleolar RNA (snoRNA), long non-coding RNA (lncRNA), micro RNA (miRNA), Ribozyme und einige andere mehr. Einen Überblick über die Fülle gibt die Datenbank Rfam (https://rfam.org/), in der man sich beispielsweise alle RNA-Familien anzeigen lassen kann, die im Menschen bisher identifiziert wurden. Diese RNA-Moleküle können vielfältige Funktionen übernehmen: vom Zerschneiden anderer RNA-Moleküle durch Ribozyme bis hin zur Feinmodulierung der Proteinbiosynthese durch miRNA, basierend auf einem Mechanismus, den man als RNA-Interferenz bezeichnet.

Die bahnbrechende Entdeckung der RNA-Interferenz gelang 1998 Andrew Fire und Craig Mello, wofür diese 2006 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin erhielten. Sie zeigten, dass miRNA-Moleküle in der Zelle gebildet werden, um gezielt mRNA stumm zu schalten und dadurch die Biosynthese bestimmter Proteine zu blockieren. Mittlerweile weiß man, dass miRNA lebensnotwendig sind und dass wahrscheinlich 60 bis 90 Prozent unserer Gene auf Ebene der Translation über miRNA reguliert werden (1).

Spätestens seitdem bekannt ist, dass eine Dysregulation bestimmter miRNA kausal an der Entstehung von Tumoren beteiligt ist, rückten diese RNA-Moleküle und der Mechanismus der RNA-Interferenz (RNAi) in den Fokus der Arzneimittelentwicklung (2).

Das Herzstück der RNA-Interferenz bilden kurze doppelsträngige RNA-Moleküle mit einer Länge von 15 bis 30 Basenpaaren. Derartige doppelsträngige RNA-Moleküle können auch als synthetische RNA-Moleküle therapeutisch genutzt werden und werden dann als small interfering RNA (siRNA) bezeichnet.

Wird eine siRNA einem Patienten appliziert und gelingt es ihr, in eine Zelle einzudringen, trifft sie im Zytoplasma auf den sogenannten RNAi-Apparat, den die siRNA benötigen, um »scharf gestellt« zu werden. Dieser RNAi-Apparat wird auch als »RNA-induced silencing complex (RISC)« bezeichnet. Er besteht aus drei Proteinen mit ganz bestimmen Funktionen, die letztlich eine unscheinbare doppelsträngige RNA in ein scharfes Schwert zur Regulation der Genexpression verwandeln (Kasten).

Warum ist das siRNA-Konzept als Interventionsoption so interessant? Die meisten etablierten Therapieansätze zielen darauf ab, die Funktion eines bestimmten Proteins zu inhibieren. Das gelingt mal besser und mal schlechter. Man geht davon aus, dass nur ungefähr 1,5 Prozent unseres Genoms für etwa 20.000 Proteine codieren, von denen nur 10 bis 14 Prozent aktive Bindungsstellen haben, die durch kleine Moleküle angesteuert werden können (4, 5). Es bleiben also noch sehr viele Zielstrukturen übrig, die (bisher) nicht durch klassische Wirkstoffe adressiert werden können. Zudem ist es aufwendig und langwierig, ein geeignetes Molekül zu entwickeln, das die gewünschte Wirkung und möglichst wenige Nebenwirkungen hat.

Über siRNA beziehungsweise Sirane könnten theoretisch alle 20.000 Proteine relativ einfach und sehr spezifisch adressiert werden. Der Vorteil ist, dass diese Moleküle ziemlich einfach herstellbar sind – man braucht letztlich nur die richtige Sequenz, die zur zu stoppenden mRNA komplementär ist.

Wie immer, so liegen auch bei Design und Verwendung von siRNA die Probleme in den Details.

Beispielsweise müssen beim Design einer siRNA besondere Anforderungen an die Länge und die Sequenz beachtet werden. Ist die RNA kürzer als 15 Basenpaare, funktioniert sie nicht als RNAi-Molekül. Ist sie länger als 30 Basenpaare, kann sie als vermeintlich virale Infektion interpretiert werden, die die zelluläre Abwehr in Form des angeborenen Immunsystems mobilisiert (6). Außerdem muss es für den RISC eindeutig klar sein, welcher der beiden RNA-Stränge als komplementärer Strang zu einer zellulären RNA fungiert (der Antisense-Strang) und den Abbauprozess der zu blockierenden mRNA steuert. Um dieses Problem zu lösen, werden die Basen möglichst ungleichmäßig verteilt: Der Antisense-Strang der siRNA sollte am 5'-Ende vor allem aus Adenosin- und Uridin-Bausteinen bestehen, während am 3'-Ende Guanosin- und Cytidin-Moleküle vorherrschen sollten (3).

Mittlerweile kennt man etliche Eigenschaften, die eine ideale siRNA haben muss beziehungsweise nicht haben darf, damit die RNA-Interferenz gut funktioniert (Kasten). Diese Optionen lassen sich nicht mehr per Augenschein berücksichtigen, weshalb verschiedene Firmen über Online-Plattformen ein gezieltes Design (mit direkter Bestelloption) für maßgeschneiderte siRNA-Moleküle anbieten.

Doch wie stabilisiert man eine therapeutische RNA, um akzeptable pharmakokinetische Eigenschaften zu erreichen? Denn das ganz große Problem der siRNA sind die Instabilität und Polarität von RNA-Molekülen mit ihren Ribose-Phosphat-Rückgraten. So schätzt man, dass »nackte«, also unmodifizierte und nicht verpackte siRNA-Moleküle im Blut eine Halbwertszeit von gerade einmal fünf Minuten haben (3).

Dieses und andere pharmakokinetische Probleme werden heute durch chemische Modifikationen bestimmter Bausteine innerhalb der siRNA gelöst. Dadurch wird nicht nur sichergestellt, dass die Moleküle nicht mehr so leicht von Nukleasen abgebaut werden, sondern auch, dass die Reaktion des angeborenen Immunsystems auf das fremde Molekül deutlich milder verläuft.

Im Prinzip lassen sich in einer RNA alle drei Grundbausteine – Ribose, Base und Phosphatgruppe – verändern. Allerdings kristallisierten sich gerade die 2'-Modifikation der Ribose und die Verwendung von Phosphorothioaten als besonders geeignet heraus. Ein Blick auf die Struktur der zugelassenen siRNA-Therapeutika zeigt, dass – außer bei Patisiran – alle Nukleotidpositionen chemisch verändert sind (Abbildung 2, Seite 38). Die vermeintlich natürlichen Wirkstoffe sind also »Kunstmoleküle«.

Bleibt noch das Problem der Aufnahme in die Zellen. Aus den Erfahrungen mit zugelassenen Formulierungen, zum Beispiel für die Zytostatika Doxorubicin oder Vincristin, boten sich Lipidnanopartikel (LNP) für die Verpackung der siRNA-Moleküle an. Diese LNP bestehen primär aus Phospholipiden und Cholesterol und ahmen Biomembranen nach. Durch Einlagerung weiterer Bestandteile erhalten die LNP spezielle Eigenschaften. Entsprechend modifizierte LNP können beispielsweise mit dem Apolipoprotein E3 interagieren und werden dadurch zu Hepatozyten transportiert.

Als Alternative zu LNP lassen sich Konjugate herstellen, die aus siRNA und beispielsweise einem Antikörper, Cholesterol oder N-Acetyl-Galactosamin (GalNAc) bestehen. Gerade die Modifikation mit GalNAc hat sich bewährt, um siRNA in Hepatozyten einzuschleusen, da auf der Oberfläche dieser Zellen passende Asialoglycoprotein-Rezeptoren (ASGPR) exprimiert werden. Dazu werden über ein Linkermolekül triantennäre GalNAc-Einheiten kovalent an den Sense-Strang der siRNA gekoppelt. Sehr effizient finden derartige Moleküle nach subkutaner Applikation ihren Weg in die Leber (3).

Aus dem Wirkmechanismus der siRNA-Moleküle lässt sich ableiten, dass all jene Erkrankungen, bei denen ein Protein als »Übeltäter« identifiziert wurde, zumindest in der Theorie über RNA-Interferenz therapiert werden könnten. Denn wenn das Protein nicht mehr (so stark) exprimiert wird, kann dies zur Linderung der Krankheit führen. Bisher sind fünf Sirane für vier Indikationen zugelassen (Tabelle und Abbildung). Alle werden parenteral verabreicht.

Die hereditäre Transthyretin-vermittelte Amyloidose (hATTR) ist eine autosomal dominant vererbte Erkrankung, deren Prävalenz in Europa bei 0,1 pro 10.000 liegt. Es gibt etwa 5000 bis 6000 Patienten. Die physiologische Aufgabe von Transthyretin (TTR) ist der Transport von Thyroxin und Retinol im Körper. Durch eine Mutation im TTR-Gen kommt es zur Bildung von Fibrillen und deren Ablagerung in verschiedenen Geweben. Charakterisiert ist die Erkrankung vor allem durch progressive sensorische und motorische Funktionsstörungen. Unbehandelt sterben die Patienten innerhalb von fünf bis 13 Jahren nach Diagnosestellung.

Die beiden für erwachsene Patienten zugelassenen siRNA-Moleküle Patisiran (Onpattro®), das seit 2018 verfügbar ist, und Vutrisiran (Amvuttra®), das Ende 2022 in den Markt eingeführt wurde, adressieren die TTR-mRNA und reduzieren die Menge an gebildetem Protein um 80 bis 96 Prozent. Damit steht allerdings auch weniger TTR für den Retinol-Transport zur Verfügung, weshalb beim Einsatz beider Arzneimittel eine Supplementation mit etwa 2500 IE Vitamin A pro Tag empfohlen wird.

Pharmakodynamisch unterscheiden sich die beiden Wirkstoffe kaum. Die zeitlich gemittelte prozentuale Reduktion der TTR-Talspiegel bis Monat 18 betrug 84,7 Prozent bei Vutrisiran und 80,6 Prozent bei Patisiran. Die häufigsten Nebenwirkungen unter Patisiran sind periphere Ödeme und infusionsbedingte Reaktionen. Patienten, die Vutrisiran erhalten, klagen gelegentlich über Schmerzen in einer Extremität (15 Prozent) und Arthralgie (11 Prozent).

Mit einer Prävalenz von etwa 1,01 pro 100.000 kommt die seltene Erbkrankheit »Akute hepatische Porphyrie« in Europa vor. Bei dieser Erkrankung ist die Biosynthese des Häms infolge einer Mutation in einem der relevanten Enzyme gestört.

Das geschwindigkeitslimitierende Enzym in der Häm-Biosynthese in der Leber ist die Aminolävulinsäure-Synthase 1 (ALAS-1), deren Expression durch die Konzentration an freiem Häm in der Zelle negativ reguliert wird. Ist eines der nachgeschalteten Biosynthese-Enzyme mutiert und dadurch inaktiv, entsteht nicht ausreichend Häm in der Leberzelle. Infolgedessen wird mehr ALAS-1 gebildet, wodurch wiederum vermehrt die neurotoxischen Substanzen Aminolävulinsäure und Porphobilinogen entstehen. Charakterisiert ist die Erkrankung durch anfallartige, starke abdominale Schmerzen und neurologische Symptome.

Die siRNA Givosiran (Givlaari®) induziert den Abbau der ALAS-1-mRNA und reduziert damit die Blutspiegel der Neurotoxine um etwa 80 bis 90 Prozent. Die Häm-Biosynthese in Erythrozyten ist nicht betroffen, denn hier ist die ALAS-2 aktiv.

Givosiran erhielt 2020 die Zulassung für Patienten ab zwölf Jahren (Tabelle). Da unter der Behandlung die Transaminase-Werte steigen können, sollten vor Beginn der Therapie und während der ersten sechs Behandlungsmonate monatlich Leberfunktionstests erfolgen. Bei klinisch relevanten Transaminase-Erhöhungen ist eine Unterbrechung der Therapie oder ein Abbruch in Betracht zu ziehen. Ebenfalls müssen die Nierenwerte sorgfältig kontrolliert werden, da bei einigen Patienten erhöhte Serumkreatinin- und verringerte eGFR-Werte aufgetreten sind.

Zu bedenken ist auch, dass durch die Behandlung mit Givosiran die Aktivität bestimmter Cytochrom-P-450-Enzyme abnehmen kann. Als Konsequenz des reduzierten hepatischen Metabolismus wurden erhöhte Plasmaspiegel von Coffein (CYP1A2), Dextromethorphan (CYP2D6), Omeprazol (CYP2C19) und Midazolam (CYP3A4) beschrieben. Unter Umständen muss die Dosis einer kritischen Begleitmedikation angepasst werden. Obwohl alle fünf bisher zugelassenen Sirane mit einem Hepatozyten-Targeting ausgestattet sind, tritt das Problem eines reduzierten Metabolismus nur bei Givosiran auf.

Das Target Proproteinkonvertase Subtilisin/Kexin Typ 9 (PCSK9) für eine Therapie der primären Hypercholesterolämie ist schon länger bekannt und wird beispielsweise von den monoklonalen Antikörpern Evolocumab (Repatha®) und Alirocumab (Praluent®) gehemmt. Auf Hepatozyten bindet PCSK9 an LDL-Rezeptoren, woraufhin der Komplex internalisiert und abgebaut wird. Wird die PCSK9 gehemmt, können LDL-Rezeptoren weiterhin LDL-Cholesterol (LDL-C) aus dem Blut abfangen. Alternativ zur Hemmung des Proteins über monoklonale Antikörper kann aber auch die PCSK9-Biosynthese reduziert werden.

Dies gelingt mit Inclisiran (Leqvio®), das seit Anfang 2021 zur Verfügung steht. Dieser siRNA-Wirkstoff induziert über den Abbau der PCSK9-mRNA nach 30 bis 60 Tagen eine mittlere LDL-C-Senkung um 49 bis 51 Prozent. Leqvio® ist zugelassen zur Behandlung von Erwachsenen mit primärer, heterozygot familiärer und nicht familiärer Hypercholesterolämie oder gemischter Dyslipidämie zusätzlich zu einer diätetischen Therapie. Es wird kombiniert mit einem Statin und anderen lipidsenkenden Therapien bei Patienten, die mit der maximal tolerierten Statindosis die LDL-C-Zielwerte nicht erreichen.

Die Primäre Hyperoxalurie Typ 1 (PH1) ist eine seltene, autosomal-rezessiv vererbte Störung des Glyoxylat-Zyklus in Zellen und tritt in Europa mit einer Prävalenz von etwa 0,05 pro 10.000 auf. Ursache für die Störung ist eine mutierte Alaninglyoxylat-Aminotransferase (AGT), wodurch Glyoxylat im Peroxisom nicht mehr in Glycin umgewandelt werden kann. Stattdessen entsteht vermehrt Oxalat im Zytosol, das in Form von Calciumoxalat-Kristallen ausfällt. Die Konsequenzen sind Nierensteine und eine eingeschränkte Nierenfunktion mit möglicher systemischer Oxalose, wodurch Augen, Herzmuskel, Haut und Knochen sowie das ZNS geschädigt werden.

Lumasiran (Oxlumo®) bindet an die mRNA, die für die Glycolatoxidase (GO) codiert. Dieses peroxismale Enzym ist für die Umwandlung von Glycolat in Glyoxylat verantwortlich. Durch die siRNA-Therapie kann die Oxalatmenge im Urin im Vergleich zum Ausgangswert um etwa 65 Prozent reduziert werden.

Das für alle Altersgruppen zugelassene Präparat wird subkutan injiziert, am besten in Unterbauch, Oberarm oder Oberschenkel. Die empfohlene Dosis richtet sich nach dem Körpergewicht und besteht aus Initialdosen einmal monatlich über drei Monate, gefolgt von Erhaltungsdosen (Tabelle, Seite 39). Die Nebenwirkungen sind überschaubar. In den klinischen Studien traten neben Abdominalschmerzen Reaktionen an der Injektionsstelle wie Erytheme, Schmerzen, Juckreiz und Schwellungen auf.

Die zugelassenen Sirane zeigen deutlich: Das Prinzip der RNA-Interferenz lässt sich therapeutisch sehr gut nutzen. Voraussetzung ist, dass der Pathomechanismus einer Erkrankung sehr gut aufgeklärt und verstanden ist, denn man muss durch die gezielte Ausschaltung eines Proteins einen Therapieerfolg erzielen können, ohne gleichzeitig einen (lebens)wichtigen biochemischen Prozess zu inhibieren.

Neben Tumorerkrankungen, bei denen beispielsweise onkogene Proteine durch RNA-Interferenz ausgeschaltet werden, können auch wichtige Oberflächenproteine pathogener Viren oder Rezeptoren und Kanalproteine, zum Beispiel bei Augenerkrankungen, adressiert werden – der Fantasie sind praktisch kaum Grenzen gesetzt.

Allerdings stellt die zielgerichtete Applikation immer wieder eine Herausforderung dar. Die bisher zuge-lassenen Sirane steuern alle entweder über Lipidnanopartikel mit Apolipoprotein E3 oder über GalNAc-Konjugate recht erfolgreich Hepatozyten an. Für andere Zielgewebe müssen neue Konjugate gefunden werden. Dies könnten beispielsweise RGD-(Arginin-Glycin-Asparaginsäure-)Motive für die Bindung an Integrine oder Folat für die Interaktion mit Folatrezeptoren auf Tumorzellen sein.

Bleibt noch die Frage nach dem Vehikel. Aus LNP gelangen üblicherweise nur 1 bis 2 Prozent der eingesetzten siRNA aus den Endolysosomen ins Zytoplasma – das sollte noch besser werden. Neben den speziellen Konjugaten und LNP sind auch Exosomen in der Testung. Es gibt wahrscheinlich nicht die eine siRNA-Formulierung, die für alles verwendet werden kann, sondern es muss für jede Indikation die richtige Applikationsform gefunden werden.