Transportproteine

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Die Achillesferse neuer Antibiotika

Als Asobiotika werden Antisense-Oligonukleotide bezeichnet, die an die mRNA essenzieller bakterieller Gene binden. Dadurch blockieren sie die Translation der mRNA und hemmen somit das Wachstum der Bakterien. Um ihre Stabilität zu steigern, werden einige Vertreter als Peptid-Nukleinsäuren (PNA) konstruiert. Diese besitzen statt eines Phosphoribose-Rückgrats ein neutrales Pseudopeptid-Rückgrat, wodurch sie deutlich besser vor einem Nukleaseabbau geschützt sind als klassische Oligonukleotide. Allerdings tun sich PNA schwer, bakterielle Membranen zu überwinden. Deswegen werden sie mit zellpenetrierenden Peptiden, sogenannten Cell-Penetrating Peptides (CPP), verknüpft. Genau diese Transportkomponente könnte sich jedoch als Schwachstelle, möglicherweise aber auch als besonderer Vorteil dieser Technologie erweisen. Die Ergebnisse wurden nun in »Nature Communications« veröffentlicht.

Das Team um Dr. Adam J. Mulkern vom Institute for Molecular Bacteriology am Twincore Centre for Experimental and Clinical Infection Research untersuchte systematisch, wie Bakterien Resistenzen gegen verschiedene CPP-PNA-Konjugate entwickeln. Das Twincore ist eine gemeinsame Einrichtung der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) und des Helmholtz-Zentrums für Infektionsforschung (HZI). Dafür setzten die Forschenden sechs Stämme aus vier klinisch relevanten gramnegativen Spezies (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica und Pseudomonas aeruginosa) einer experimentellen Evolution unter schrittweise steigendem Selektionsdruck aus. Die CPP-PNA-Konjugate richteten sich gegen die essenziellen Gene acpP und rpsH, die für das Überleben der Bakterien notwendig sind. Als Transportmoleküle verwendeten die Forschenden die zellpenetrierenden Peptide (KFF)₃K und (RXR)₄XB. Sie erleichtern die Aufnahme der Antibiotika, indem sie die äußere Membran der Bakterien durchlässiger machen.

Dabei beobachteten die Forschenden deutliche Unterschiede in der Resistenzentwicklung. Besonders schnell entwickelten sich Resistenzen gegen die mit (KFF)₃K gekoppelten PNA. Bei Salmonella enterica stieg die minimale Hemmkonzentration (MIC) gegenüber KFF-acpP im Mittel um das 17,6-Fache. Bei E. coli führte KFF-acpP im Mittel zu einem sechsfachen MIC-Anstieg, während KFF-rpsH einen 2,5-fachen Anstieg bewirkte. Robuster erwies sich dagegen RXR-acpP. Bei E. coli betrug der mittlere MIC-Anstieg lediglich das 1,4-Fache. Zum Teil ließ sich bei mit RXR-acpP behandelten Populationen überhaupt kein MIC-Anstieg nachweisen.

Damit beeinflusst offenbar nicht allein die Sequenz des Antisense-Wirkstoffs, sondern vor allem auch dessen molekulares Transportsystem, wie leicht Bakterien eine Resistenz entwickeln.

Bei der Behandlung mit KFF-konjugierten PNA fanden die Forschenden über mehrere Spezies hinweg besonders häufig Mutationen im Gen sbmA. Dieses Gen kodiert einen Transporter der inneren Membran der Bakterien, der für die Aufnahme von KFF-PNA benötigt wird. Mutationen, die diesen Transportweg beeinträchtigen, reduzieren somit den Eintritt des Wirkstoffs in die Zelle.

Bei E. coli fanden sich zudem häufig Veränderungen in yaiW, einem zusammen mit sbmA transkribierten Gen für ein Protein der äußeren Membran, sowie in ykfM, das für ein bislang wenig charakterisiertes Transmembranprotein kodiert.

Weitere Mutationen deuten auf ein komplexes Netzwerk möglicher Anpassungsreaktionen hin. Dazu gehören Veränderungen in Genen für Membranstrukturen, Stressantworten, Transportprozesse und Effluxsysteme. Die Autoren betonen allerdings, dass nicht jede während der Evolution beobachtete Variante zwangsläufig kausal zur Resistenz beiträgt.

Besonders interessant ist das Verhalten des RXR-konjugierten Wirkstoffs, der kaum zu einer Erhöhung der MIC führte. Da dessen Aufnahme nicht von einem aktiven Transporter wie SbmA abhängt, bot sich den Bakterien offenbar kein vergleichbar einfacher genetischer Ausweg.

Nur zwei von zehn E.-coli-Populationen entwickelten eine messbar verminderte Empfindlichkeit. In beiden Fällen konnten die Forschenden Punktmutationen direkt im zentralen Bereich der PNA-Bindestelle von acpP nachweisen.

Gerade dieser Resistenzweg könnte eine besondere Stärke programmierbarer Antibiotika offenbaren. Während sich eine Mutation in einem bakteriellen Aufnahmesystem nicht ohne Weiteres durch eine veränderte PNA-Sequenz umgehen lässt, kann eine mutierte Zielsequenz prinzipiell durch Neuprogrammierung des Antisense-Oligomers adressiert werden. Die Autoren argumentieren deshalb, dass sich entsprechende Resistenzvarianten vergleichsweise einfach durch ein Update der PNA-Sequenz umgehen ließen.

Für die Entwicklung künftiger Antisense-Antibiotika ergibt sich daraus eine zentrale Konsequenz: Nicht nur die Auswahl einer hochwirksamen Zielsequenz ist entscheidend, sondern ebenso die Wahl des Delivery-Systems. Ein CPP, dessen Aufnahme von einem einzelnen bakteriellen Transportprotein abhängt, kann einen leicht zugänglichen evolutionären Fluchtweg eröffnen. Transportmechanismen wie beim RXR-Peptid könnten dagegen eine höhere Barriere gegen Resistenzentwicklungen schaffen.

Die Ergebnisse müssen allerdings im Kontext des Versuchsdesigns betrachtet werden. Die Forschenden weisen selbst darauf hin, dass das beobachtete Mutationsspektrum vom verwendeten Selektionsregime abhängt. Die schrittweise Erhöhung der Wirkstoffkonzentration im Labor kann andere Resistenzwege begünstigen als eine abrupte Hochdosistherapie oder schwankende Wirkstoffkonzentrationen unter klinischen Bedingungen.

Daher erlaubt die Studie keine Prognose darüber, mit welcher Häufigkeit die beschriebenen Mutationen bei einer späteren therapeutischen Anwendung auftreten würden. Sie zeigt jedoch, welche genetischen Ausweichrouten grundsätzlich verfügbar sind – und eröffnet damit die Möglichkeit, die evolutionäre Robustheit bereits beim Wirkstoffdesign zu berücksichtigen.