Gentechnische Sicherheit

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Rekombinante Gerinnungsfaktoren

Ein Schlüsselenzym der Blutgerinnungskaskade ist der Gerinnungsfaktor IX, der nach dem Patienten Stephen Christmas, an dem die Krankheit im Jahr 1952 genauer beschrieben wurde, auch als Christmas-Faktor bezeichnet wird. Im Komplex mit FVIIIa, Calcium-Ionen und Phospholipiden der Thrombozyten-Oberfläche bindet der FIXa an Faktor X und aktiviert ihn. Mehr als 1000 Mutationen im Gen können dazu führen, dass kein funktionsfähiger Gerinnungsfaktor gebildet wird und eine Hämophilie B resultiert.

Das Polypeptid aus 415 Aminosäuren wird am N-Terminus umfassend Vitamin-K-abhängig γ-carboxyliert, was für die Bindung von Calcium-Ionen nötig ist. Weitere posttranslationale Modifikationen sind N- und O-Glykosylierung, Phosphorylierung, β-Hydroxylierung und Sulfatierung. Disulfidbrücken sorgen für die korrekte Konformation des Proteins.

Genau diese posttranslationalen Modifikationen und vor allem die γ-Carboxylierung des Proteins waren die Herausforderung der gentechnischen Herstellung. Die Lösung des Problems bestand in der Etablierung einer CHO-Expressionszelllinie, die so verändert wurde, dass sie alle für die γ-Carboxylierung nötigen Enzyme exprimiert. Neben den älteren rekombinant hergestellten Präparaten gibt es Varianten mit verlängerter Halbwertszeit (Tabelle 2), die durch Fusion mit einem Antikörper-Fc-Teil oder mit Albumin beziehungsweise durch Modifikation mit einer PEG-Kette erreicht wurden.

Nonacog alfa entspricht der Isoform des humanen FIX und ist ein einkettiges Glykoprotein mit 415 Aminosäuren (Abbildung 3). FXIa oder der Komplex aus Tissue Factor (TF) und FVIIa schneiden das Aktivierungspeptid aus FIX und bilden dadurch die dimere Form des Gerinnungsfaktors. Nonacog gamma unterscheidet sich von Nonacog alfa nur im Glykosylierungsmuster. Die PEG-Kette bei Nonacog beta pegol ist an den Sequenzbereich des Aktivierungspeptids gekoppelt und wird bei der Aktivierung abgeschnitten.

Bei Albutrepenonacog alfa wurde an die Sequenz für den Faktor IX noch die von Serumalbumin angehängt. Dadurch entsteht ein Fusionsprotein, das im Plasma deutlich stabiler ist. Zwischen den beiden Fusionspartnern wurde ein Linker eingebaut, der eine weitere Schnittstelle für FXIa beziehungsweise TF/FVIIa trägt. Bei der Aktivierung von FIX wird somit nicht nur das Aktivierungspeptid ausgeschnitten, sondern auch der Albumin-Anteil eliminiert. Das bedeutet, dass die Modifikationen ebenso wie bei Nonacog beta pegol bei der Aktivierung des rekombinanten FIX verloren gehen.

Eftrenonacog alfa ist das Fusionsprotein aus dem Gerinnungsfaktor IX mit dem Fc-Teil eines IgG1-Moleküls (Abbildung 3, unten). Zusätzlich wird in der Produktionszelllinie der Fc-Teil allein exprimiert, sodass die Proteine noch in der Zelle dimerisieren. Auch nach der Aktivierung des Gerinnungsfaktors bleibt das Fc-Dimer mit FIX verbunden.