Heteroresistenz als mögliche Ursache

Seit der Auffindung von Penicillin durch Alexander Fleming 1929 kämpfen wir bei der Behandlung von Infektionen mit bakteriellen Resistenzen gegen jedes Antibiotikum. Im Lauf der Jahrzehnte sind antimikrobielle Resistenzen (AMR) lebensbedrohlich geworden. Schätzungen zufolge werden 2050 weltweit 10 Millionen Menschen jedes Jahr an Infektionen sterben, die von resistenten Bakterien verursacht werden (1). Einziger Ausweg ist, neue Antibiotika mit neuen Wirkmechanismen zu entwickeln und weniger Antiinfektiva einzusetzen.

Insofern war die Markteinführung von Cefiderocol Anfang 2021 sehr willkommen, da dieses Cephalosporin gegen ein Panel an Carbapenem-resistenten Pathogenen wie gramnegative Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae und Enterobacteriales wirksam sein soll.

In klinischen Studien wurde Cefiderocol, das für die Penetration in die Bakterien ein Eisentransportsystem nutzt, gegen Meropenem und die bestmögliche Therapie bei nosokomialer Pneumonie, Sepsis und komplizierten Harnwegsinfektionen getestet (2, 3). In fast allen Fällen war es der Vergleichstherapie nicht unterlegen. Erschreckend war aber, dass bei Acinetobacter-Infektionen die 14-Tage-Mortalität geringfügig schlechter war, obgleich die bakteriellen Isolate eine sehr geringe Minimale Hemmkonzentration (MHK) aufwiesen, die auf eine ausreichende Empfindlichkeit schließen ließ. Die Gruppe von Weiss stellte die Hypothese auf, dass eine sogenannte Heteroresistenz vorlag, was durch In-vitro-Daten gestützt wurde (4).

Grob gesagt: Heteroresistenz ist eine besondere Form der Resistenz, bei der eine Subpopulation an Bakterien schon vor der ersten Konfrontation mit dem Antibiotikum resistent ist, während alle anderen Bakterien empfindlich gegen das eingesetzte Antibiotikum sind. Unter Antibiotikagabe vermehren sich die resistenten Bakterien und halten die Infektion aufrecht. Das Antibiotikum wirkt klinisch nicht oder nur eingeschränkt. Im Unterschied zur »normalen« Resistenz bildet sich nach Abschluss der antiinfektiven Therapie wieder eine Mischung aus empfindlichen Bakterien mit einer Subpopulation resistenter Keime, da Letztere ihre Resistenz teilweise wieder verlieren. Daher spricht mal wohl von Heteroresistenz.

Wie entsteht diese besondere Form der Resistenz und was unterscheidet sie von einer »normalen« Resistenz oder der Persistenz? Welche Bakterien werden gegen welche Antibiotika heteroresistent? Um diese Fragen zu beantworten, sollen zunächst die verschiedenen Resistenzformen erklärt werden.

Das Wort Resistenz beschreibt die generelle Widerstandsfähigkeit eines Krankheitserregers gegen Antibiotika. In diesem Fall ist die MHK so groß, dass selbst bei Anwendung der höchst möglichen Wirkstoffdosis die Erreger nicht abgetötet werden und ein therapeutischer Erfolg nicht möglich ist. Während zu Therapiebeginn noch suszeptible Bakterien vorhanden sein können, sind nach der Behandlung alle Zellen der Bakterienpopulation phänotypisch resistent (Abbildung 1, oben).

Toleranz bezeichnet den temporären Zustand einer gesamten Population sensitiver Bakterien, die eine vorübergehende Exposition eines Antibiotikums aufgrund ihres aktuellen physiologischen Zustands, zum Beispiel Schlafzustand (Dormanz), Hungern oder reduziertem Metabolismus, überleben. Mit anderen Worten: Es handelt sich nicht im eigentlichen Sinn um eine Resistenz, auch wenn das klinische Bild ähnlich ist. Eine Dormanz kann auch ein extrem langsames Wachstum bedeuten, sodass beispielsweise β-Lactame keine Wirkung entfalten (5). Im Unterschied zur Resistenz, die meist spezifisch gegen ein Antibiotikum oder eine Wirkstoffgruppe besteht, können Bakterien gegen mehrere (bakterizide) Antibiotika tolerant sein.

Tolerante Bakterien haben eine verlängerte »Minimum Duration for Killing« (MDK). Die MDK ist die Zeit, die notwendig ist, um 99 Prozent der Bakterien mit einer sehr hohen Antibiotikakonzentration zu töten, bei meist gleicher MHK empfindlicher Erreger. Eine längere Behandlungsdauer ist also notwendig.

Von Persistenz spricht man, wenn empfindliche und tolerante Keime nebeneinander vorliegen (sogenannte Populationsheterogenität – Abbildung 1 Mitte). Dann tötet ein Antibiotikum schnell alle empfindlichen Erreger einer Population, aber eine kleine Subpopulation (häufig weniger als 1 Prozent) überlebt, da sie sich in einer Art Schlafzustand befindet (siehe Toleranz) und daher nicht getroffen werden kann. Man nennt sie »Persister«. Nach Therapieende entsteht wieder das Gemisch aus empfindlichen und toleranten Bakterien. Zunächst ebbt die Infektion also ab und flammt dann wieder auf. Man weiß heute, dass der Schlafzustand und das »Aufwachen« genetisch kodiert sind, aber die Mechanismen sind weitgehend ungeklärt. Zur Eradikation der persistenten Zellen sind hohe Antibiotikakonzentrationen (deutlich über der MHK) und eine lange Therapiedauer notwendig.

Das Phänomen der Heteroresistenz wurde bereits 1947 zum ersten Mal erwähnt. Sie ist – wie die Persistenz – durch eine Populationsheterogenität gekennzeichnet. Man spricht von Heteroresistenz, wenn in einer Bakterienpopulation vorübergehend Subpopulationen mit unterschiedlichem Grad an antimikrobiellen Resistenzen und empfindliche Erreger, die den »Löwenanteil« ausmachen, nebeneinander vorliegen. Die MHK ist mehr als achtmal so hoch wie bei normal empfindlichen Erregern (6).

Die resistente Population wächst unter Antibiotika-Exposition, während die empfindlichen Keime absterben, sodass nur noch resistente Bakterien vorhanden sind. Wird das Antibiotikum abgesetzt, können einige resistente Bakterien ihre Resistenzgene verlieren und werden wieder empfindlich. Letztlich liegt wieder eine gemischte Population vor (Abbildung 1, unten).

Der Ursprung der transient resistenten Subpopulation kann verschieden sein, was in eine Variabilität der Resistenz münden kann. Bei einer gemischten Population mit unterschiedlichen Genotypen spricht man von Polyklonalität (Beispiel: verschiedene Klone in verschiedenen Organen). Heteroresistenz kann auch aus einem Klon entstehen, indem dieser in hoher Frequenz in zwei Populationen – empfindlich und resistent – differenziert (7, 8); hier spricht man von Monoklonalität. Diese erzeugt für einige Generationen eine transiente Antibiotika-Unempfindlichkeit, die aber nach Wegnahme des Selektionsdrucks wieder verschwindet.

Die Heteroresistenz kann ihren Ursprung auch in Punktmutationen, DNA-Insertionen oder -deletionen haben. Aber nicht jede Mutation mündet in eine verbesserte Überlebenschance der Mikroorganismen.

► Eine Heteroresistenz ist meistens instabil (9) und dies unterscheidet sie wesentlich von einer normalen Resistenz.

Zwischenfazit: Sowohl persistente als auch heteroresistente Zellen können eine Antibiotikatherapie mit »normalen« Dosen überleben und somit ist eine vollständige Eradikation nicht möglich. Daher kommt es nicht nur zum akuten Therapieversagen (siehe Cefiderocol), sondern es kann auch eine chronische oder wiederkehrende Infektion auftreten. Das haben sie mit resistenten Bakterien gemein. Allerdings besteht die Möglichkeit einer Heilung mit hohen Antibiotikadosen bei langer Therapiedauer.

Eines vorweg: »Normale« Resistenzen und Heteroresistenzen haben gemeinsame Mechanismen – sowohl intrinsische als auch extrinsische.

• Dem Bakterium fehlt das Target des Antibiotikums. Daptomycin wirkt beispielsweise nicht gegen gramnegative Bakterien, da deren Membran (im Unterschied zu grampositiven Erregern) nur einen geringen Anteil an anionischen Phospholipiden enthält. So kann Daptomycin zusammen mit Calciumionen keine Komplexe bilden, die für den toxischen Efflux von Zellbestandteilen verantwortlich sind.
• Der Erreger exprimiert ein »angeborenes« Resistenzgen wie die Lactamase, die Betalactame (Penicilline) zerlegt. Lactamasen sind seit den 1940er-Jahren bekannt, waren aber schon vorher vorhanden.
• Das Antibiotikum kann die äußere Bakterienmembran nicht überwinden und kommt nicht zu seinem Wirkort. Dies gilt zum Beispiel für das Glykopeptid Vancomycin, das das Peptidoglykan-Crosslinking hemmt, aber bei gramnegativen Bakterien nicht ins Periplasma gelangen kann.
• Das Antibiotikum wird durch eine Effluxpumpe sofort wieder nach außen transportiert, sodass es seine Wirkung nicht entfalten kann. Insbesondere gramnegative Bakterien verfügen natürlicherweise über ein ganzes Arsenal an Effluxpumpen, um sich vor jeglichen Xenobiotika zu schützen. Deshalb wirkt Linezolid nicht gegen gramnegative Bakterien.

• Mutationen an der Zielstruktur können das effektive Binden der Antibiotika verhindern. Wenn es viele identische Kopien des mutierten Targets im Bakterium gibt, kann bei Antibiotika-Anwendung eine Selektion der mutierten Kopie gefolgt von einer hochfrequenten Rekombination zwischen homologen Allelen stattfinden, sodass es später nur noch resistente Bakterien gibt. So geschehen bei der Therapie von S.-pneumoniae-Infektionen mit Linezolid, dessen Target die 23S-rRNA ist. Dagegen haben N. gonorrhoeae Mosaikgene gebildet (durch Aufnahme von nackter DNA aus der Umgebung = Transformation), die für pan-resistente Isolate sorgen. Last but not least haben MRSA sogenannte Staphylococccal-cassette-Chromosomen (SCCmec) zusätzlich aufgesammelt, die für das Zielprotein PBP2a kodieren, das Penicilline nicht mehr richtig binden kann. Und ohne Bindung keine Wirkung auf die Zellwandsynthese.
• Posttranslationale Zielstrukturmodifikationen bedürfen keiner Genmutation auf den Chromosomen. Hier methyliert eine Erythromycin-Ribosomen-Methylase ein Adenin in der Bindetasche, sodass Makrolide nicht mehr richtig andocken können. Dasselbe gilt für Streptogramine, Lincosamine, Chloramphenicol und viele andere Antibiotika; hier liegt also eine Kreuzresistenz vor. Die Gene für diese Modifikationen liegen auf einem Plasmid und können deshalb leicht an Nachbarbakterien verteilt werden. Ähnliche Ribosomen-Methylierungen wurde in Enterobacteriaceen nach Aminoglykosid-Exposition gefunden.
• Die Inaktivierung eines Antibiotikums kann durch Hydrolyse geschehen. Es gibt Tausende von Enzymen, die β-Lactame, Phenicole, Makrolide oder Aminoglycoside hydrolytisch spalten. Am bekanntesten sind die etwa 3000 verschiedenen β-Lactamasen, die wiederum in vier Unterklassen unterteilt sind: drei Serinproteasen (A, C und D) sowie eine Metallolactamase B. Die »Extended-Spectrum-β-Lactamases« (ESBL) sind in der Lage, ein weites Spektrum an β-Lactamen zu hydrolysieren. Sie haben sich in kurzer Zeit schnell ausgebreitet und sind heute meist auf Plasmiden zu finden, was ihre Ausbreitung beschleunigt. Beispiele sind die Klebsiella pneumoniae-Carbapenemase (KPC) und die New-Delhi-Metallo-(NDM)-Carbapenemase, die nahezu weltweit in gramnegativen Erregern zu finden sind.
• Andere Bakterien übertragen funktionelle Gruppen wie Acyl-, Phosphat-, Nucleotid- oder Ribosereste auf die Antibiotika und schalten diese damit aus. Dies passiert besonders bei Aminoglykosiden. Diese Aminoglykosid-modifizierenden Enzyme (AME) sorgen dafür, dass die Antibiotika nicht mehr an ihre Zielstruktur binden können.
• Die Verringerung der Antibiotikakonzentration im Bakterium kann durch Überexprimierung von Effluxpumpen erfolgen. Es gibt einerseits spezifische Effluxpumpen, zum Beispiel für Tetracycline. Viele können jedoch eine Vielzahl von Substraten transportieren und werden deshalb »Multidrug resistance« (MDR)-Effluxpumpen genannt. Sie sind meist auf Chromosomen kodiert; einige können aber auch über Plasmide zwischen den Bakterien flott ausgetauscht werden, was besonders häufig bei gramnegativen Bakterien passiert.
• Kleine Moleküle gelangen oft via Porine in gramnegative Erreger. Die Reduktion der Porinexpression und der Ersatz der Porine durch selektivere Kanäle reduziert den Antibiotika-Einstrom und damit deren Konzentration in den Bakterien. Liegt die Konzentration in den Zellen unterhalb der MHK, wird zusätzlich die Entstehung weiterer Resistenzen, zum Beispiel Punktmutation im Target, stimuliert. Dies wurde bei Enterobacter-Spezies beobachtet.

Es sei noch erwähnt, dass intrinsisch resistente Erreger zusätzlich mehrere Resistenzgene sammeln können und damit multiresistent werden. Dann sind sie nur noch schwer zu eradizieren.

Über Heteroresistenzen wird in den letzten Jahren immer häufiger berichtet. Während zu Beginn des Jahrtausends jedes Jahr weniger als zehn Fälle in der Literatur zu finden waren, wurden allein 2020 mehr als 60 Fälle beschrieben. In Tabelle 2 sind repräsentative Beispiele für einige Bakterien und Antibiotika zusammengestellt (13). Hier finden sich die bekannten, oben erklärten Resistenzmechanismen.

Eine Heteroresistenz ist nicht einfach zu diagnostizieren, da sich die Zusammensetzung einer Population hinsichtlich resistenter Keime schnell ändern kann, sogar während eines Assays. Man verwendet meist den sogenannten PAP-Assay (Populations-Analyse-Profiling), der jedoch sehr zeit- und arbeitsaufwendig ist. Dabei wird das Bakterienwachstum in einer Blut- oder Gewebeprobe des Patienten mit einem Antibiotika-Konzentrationsgradienten (in kleinen Schritten) quantifiziert, das heißt, es wird der MHK-Wert bestimmt (entweder auf Platten und in einer Bouillon). Ab einer MHK > 8 der normalen MHK spricht man von Heteroresistenz.

Welche klinische Relevanz hat die Heteroresistenz? Da der PAP-Assay sehr aufwendig ist, gehört er nicht zur Routine des Klinikalltags. Somit ist die Diagnose schwierig und die Bedeutung der Heteroresistenz derzeit noch unklar. Viele Wissenschaftler halten sie für unterschätzt, da Resistenzen falsch klassifiziert werden. Zudem werden Heteroresistenzen immer häufiger festgestellt – wenn man die Gründe eines Therapieversagens erforscht (14).

Bleibt noch die Frage, wie man heteroresistente Erreger eradizieren kann. Wie das Cefiderocol-Beispiel zeigt, reicht eine antibiotische Monotherapie grundsätzlich nicht. Es wird eine Kombination von Antibiotika mit verschiedenen Wirkmechanismen empfohlen, da eine einzelne Subpopulation nicht gegen mehrere Antibiotika resistent ist (9). Persistente Bakterien kann man mit einem Antibiotika-Cocktail dagegen kaum töten, da sie meist gegen mehrere Antibiotika tolerant (oder resistent) sind.

Die Forscher Band und Weiss (16) haben einen Pool von Carbapenem-resistenten Enterobacter-Isolaten aus den Jahren 2012 bis 2015 in Georgia mittels PAP-Assay untersucht. Die Bakterien waren mit ganz neuen, mittelalten und sehr alten β-Lactamantibiotika behandelt worden. Erwartungsgemäß waren die mit alten Antibiotika konfrontierten Bakterien zum Beispiel gegen Ampicillin resistent und gegenüber modernen Antibiotika (Ceftazidim/Avibactam) empfindlich. Die mittelalten β-Lactame wie Meropenem, Doripenem oder Cefepim hatte dagegen häufig eine Heteroresistenz induziert.

Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass Bakterien entweder nach längerfristigem Antibiotikagebrauch in toto direkt resistent oder erst einmal nur Subpopulationen resistent werden. Dann wäre die Heteroresistenz nur eine Art Zwischenschritt auf dem Weg zur Resistenz (Abbildung 2). Diese Hypothese, die aufgrund von β-Lactam-Daten aufgestellt wurde, muss allerdings erst noch für andere Antibiotika bewiesen werden.