Membranen und Gewebe aus der Retorte |
 |
01.12.2003 00:00 Uhr |
Die moderne Biomedizin nutzt eine Vielzahl von Werkstoffen mit unterschiedlichen Eigenschaften. In der Medizintechnik werden diese als dauerhafte oder temporäre Implantatmaterialien eingesetzt. Je nach Anwendungsgebiet sind Eigenschaften von biologisch inert bis hin zu vollständig biokompatibel gefragt. Nanotechniken helfen hier weiter.
Neben Keramiken und Metallen kommen zunehmend Hydrocarbonpolymere, Fluorocarbonpolymere und Halbleiter zum Einsatz. Besonders verträgliche Gefäßprothesen sind beispielsweise modifizierte, polymere Polytetrafluorethylene (Löhbach et al., 2002; Bakowsky et al., 1999) und Implantate aus Titanwerkstoffen, die je nach Verwendungszweck temporäre (inert) oder dauerhafte (biokompatibel) Oberflächeneigenschaften besitzen können.
Im ersten Artikel zur Nanobiotechnologie in der Pharmazie (Titelbeitrag in PZ 47/03) stellten die Autoren Nanopartikel als Wirkstoffträger vor. In diesem Beitrag geht es um den Einsatz der Nanobiotechnologie beim Tissue engineering und um Methoden, mit deren Hilfe nanometerkleine Strukturen sicht- und messbar gemacht werden.
Zur Verwirklichung dieser stark variierenden Anforderungen dienen physikalische Verfahren wie die Oxidation der Oberfläche mit Plasma- oder Laserverfahren (Engstrom et al., 1984) und die Adsorption molekularer bioaktiver Substanzen (Blaedel et al., 1974), aber auch gezielte chemische Verfahren wie Ätztechniken und die kovalente Anbindung von Funktionsmolekülen an die Oberfläche (Löhbach et al., 2002). Die Eigenschaften werden dabei durch die Struktur der Oberfläche und die Änderung der biologischen Affinität (Hydrophilie, Ladung, spezifische Erkennung) und der Interaktionsfähigkeit mit natürlichem Gewebe bestimmt. Man kann die Adhäsivität der Oberfläche erhöhen, wie dies bei permanenten Implantaten, zum Beispiel Gefäßprothesen, gewünscht ist, oder aber deutlich herabsetzen, um beispielsweise einen bakteriellen Befall von Kathetern zu unterbinden.
Adhäsive Beschichtung
Der prothetische Ersatz von Blutgefäßen ist eine der wichtigen Optionen in der kardiovaskulären Chirurgie. Seit der Einführung von Dacron-Prothesen 1958 ist der Einsatz oder Bypass von großlumigen, arteriellen Gefäßen, zum Beispiel der thorakalen oder abdominalen Aorta, mit guten Langzeitergebnissen möglich. Bei kleineren arteriellen Gefäßen (Unterschenkelarterien, Koronararterien) oder im venösen System (Vena Cava) ist dies deutlich schwieriger. Die Anlagerung von Thrombozyten und die lokale Aktivierung der Blutgerinnung kann bei relativ geringem Blutfluss zur überschießenden Ausbildung von wandhaftenden Thromben mit konsekutivem Verschluss der Gefäßprothese führen.
Eine Lösung bietet die Besiedlung (Maskierung) des Implantats durch körpereigene Endothelzellen. Diese Zellen kleiden die natürlichen Blutgefäße des Organismus aus. Das Endothelium, die Gesamtheit der Endothelzellen, macht ungefähr ein Prozent des Körpergewichts aus. Es stellt nicht nur eine mechanische, semipermeable Barriere zwischen dem zirkulierenden Blut und dem umgebenden Gewebe dar, sondern hat weitergehende Funktionen wie die Regulation von Hämostase, Gefäßtonus, Gefäßstruktur, Blutgerinnung und immunologischen Prozessen. Das Prinzip der Besiedlung von Gefäßprothesen mit körpereigenen Endothelzellen ist experimentell erprobt; erste klinische Erfahrungen liegen vor.
Eine bis zu 70-prozentige Besiedlung von Gefäßprothesen, die vornehmlich aus dem inerten Polytetrafluorethylen (PTFE) bestehen, mit Endothelzellen ist innerhalb von Stunden bis Tagen möglich (Kadletz et al., 1992). Klinisch reicht diese Besiedlung der endoluminalen Oberfläche trotz des Einsatzes von Wachstumsfaktoren jedoch nicht aus (Dobbs et al., 1997; Miller et al., 1994). Dies ist offensichtlich der Grund dafür, dass die Resultate bei der Anwendung von mit Endothelzellenn besiedelten Gefäßprothesen bisher nicht signifikant verbessert werden konnten. Durch chemische Aktivierung der Oberfläche und anschließende kovalente Anknüpfung von endothelspezifisch bindenden Liganden wie Kollagen, Laminin, Fibronektin oder dem hochaffinen Invasionsfaktor Min3 von Yersinia enterocolitica wachsen Endothelzellen schneller und dichter an (Löhbach et al., 2002). Diese Schicht war resistent gegenüber einem hohen Scherstress im Blutstrom. Die Arbeiten wurden auf andere Implantatmaterialien wie Titan, Polyurethan und Silikon ausgedehnt, um auch hier Einwachsverhalten und Gewebeverträglichkeit zu verbessern.
Antiadhäsive Beschichtung
An Implantate, die wie Katheter nur zeitweilig in den Körper eingebracht werden, heften sich oft körpereigene Materialien und Bakterien an. Daraus können sich adhäsionsbedingte Entzündungen entwickeln, die man mit verschiedenen Strategien verhindern will.
Ein Weg ist es, durch ultradünne Beschichtungen antiadhäsive, antibakterielle und biokompatible Eigenschaften zu erzeugen. Dazu werden antimikrobiell wirkende Substanzen wie Chlorhexidin, Silberionen und -kolloide, Stoffe wie Benzalkoniumchlorid, die lokal toxisch auf Bakterien wirken, oder verschiedene Antibiotika wie Rifampin und Ciprofloxacin verwendet (Schierholz et al., 1998; Hollinger, 1996). Diese Wirkstoffe können entweder verpackt in Hydrogele oder Liposomen auf die Oberfläche aufgebracht oder direkt beim Herstellungsprozess in das Polymer eingelagert werden. Die Verwendung von Antibiotika in Implantaten wird derzeit kritisch diskutiert, da es bei längerer Applikation oft zu Resistenzen kommt.
Eine seit geraumer Zeit verfolgte Strategie besteht in der nachträglichen, gezielten Beschichtung der Oberflächen mit Biomembrananaloga, zum Beispiel mit verschiedenen Phospholipiden. Da bei diesen Membranbildnern nur die innere Monoschicht direkt an der Materialoberfläche verankert werden kann, sind die darauf aufbauenden Bilayer physikalisch nur wenig stabil, besitzen aber deutlich verbesserte, antiadhäsive und antibakterielle Eigenschaften.
Als Alternative bieten sich bipolare, Membran durchspannende Tetraetherlipide vom Archeaon Thermoplasma acidophilum an, da hier ein selektiver Aufbau von stabilen, funktionalisierbaren Schichten möglich ist (Freisleben et al., 1997; Bakowsky et al., 2000). Diese Membran durchspannenden Lipide sind besonders stabil gegenüber chemischen und biochemischen Angriffen. Sie sind im menschlichen Körper nur schwer abbaubar und lösen keinerlei Immunreaktion aus. Durch die Modifikation der Oberflächen wird die Primäradsorption von Proteinen, Bakterien und anderem biologischen Material merklich unterdrückt.
Nanostrukturen auf der Oberfläche
Dass die Topographie eines Substrats Auswirkungen auf das Wachstum von Zellen hat, hat Harrison bereits 1914 entdeckt (Harrison, 1914). Dies führte im Lauf der Zeit zu den Begriffen „Contact Guidance“ und „Topography Guidance“ für Phänomene, die die Korrelation von Zellwachstum und -orientierung mit geometrischen Parametern der Materialoberfläche betreffen (siehe zum Beispiel Übersichtsartikel von Curtis und Wilkinson, 1997).
Durch Mikro- und Nanostrukturierung werden Substrate gezielt verändert, um die Reaktion von diversen Zellsystemen auf verschiedene topographische Merkmale zu untersuchen. Hierzu zählten im einfachsten Fall Substrate variabler Rauigkeit (Turner et al., 1997), aber auch der Einfluss von Gräben unterschiedlicher Dimension (Brunette et al., 1999; den Braber et al., 1996). Durch halbleitertechnologische Prozesse konnte man ferner regelmäßige Anordnungen von Linien, Säulen und Vertiefungen in verschiedene Substratmaterialien einbringen (Turner et al., 2000; Walboomers et al., 1999).
Eine generelle Aussage, welche Topographie optimale Bedingungen für die Besiedlung mit Zellen bewirkt, ist allerdings nicht möglich. Dies hängt vom jeweiligen Einzelfall ab. Die erzeugten Strukturen können in einem weiten Bereich variiert werden, was ihre Geometrie und laterale Verteilung sowie Größe und Höhe betrifft. Die Abstände der Muster sind je nach Methode zwischen 100 nm und 10 µm, bei Reliefhöhen zwischen 10 nm und etwa 3 µm, frei wählbar.
Durch Bestrahlung von Polymeroberflächen mit Photonen geeigneter Wellenlänge können die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Materials verändert werden. Hierzu werden bereits UV-Lampen und für anspruchsvollere Experimente UV-Laser eingesetzt. Polymer und Strahlung interagieren auf photothermischem oder photochemischem Weg (Bäuerle, 1996). Entscheidend für die Art der Wechselwirkung sind bei gegebenem Polymer die Laserparameter wie Wellenlänge, Pulsdauer und Pulsintensität.
Die photochemische Modifizierung einer Polymeroberfläche beruht prinzipiell auf der Absorption von Photonen mit dem nachfolgenden Bruch von chemischen Bindungen. Durch interne Kopplungsprozesse können sich dann neue Bindungen ausbilden, wobei sich die chemische Zusammensetzung des Polymers und dessen Morphologie verändern (Übersicht in Chan et al., 1996). Die primäre Laserabsorption kann durch Einbau von Chromophoren gezielt beeinflusst werden (Lippert et al., 1997).
Eine interessante Möglichkeit einer photochemischen Modifizierung von Polymeroberflächen bietet das Einbringen des Substrats in eine reaktive Gasatmosphäre. Hierbei werden Gasphasenmoleküle durch die Laserstrahlung photolysiert und dadurch chemisch reaktive Spezies freigesetzt, die ihrerseits das Substrat attackieren. Natürlich können physikalische Strukturierungsmethoden mit chemischen und biochemischen kombiniert werden. Durch das neu erhaltene Oberflächendesign und die veränderten Grenzflächeneigenschaften ist eine erleichterte oder sogar selektive, der lateralen Struktur angepasste Modifikation mit biologischen Funktionsmolekülen möglich.
Molekulare Bindung im Modell
Nachweis und Visualisierung unspezifischer und spezifischer Bindungsereignisse sind entscheidend für das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen den pharmazeutischen Anwendungen der Nanobiotechnologie und biologischen Systemen. Diese Wechselwirkungen sind meist sehr vielfältig und komplex, gerade wenn man sie in vivo charakterisieren möchte.
So erfordert die Analyse von Transport- und Bindungsphänomenen den kombinierten Einsatz verschiedener Methoden. Als Modellsysteme sind Zellkulturen, oftmals basierend auf Zellmonoschichten, die biologische Barrieren nachahmen können, besonders interessant. Diese werden durch Membranmodelle aus natürlichen Zellmembranbestandteilen wie Lipiden und Proteinen ergänzt. Hier verwendet man häufig monomolekulare Lipidfilme, Langmuir-Blodgett-Filme oder Liposomen. Zur Messung setzt man bevorzugt Techniken ein, die eine direkte Analyse von Bindungsereignissen ermöglichen.
Zellkultursysteme für Darmschleimhaut
Der gerichtete und kontrollierte Transport neuartiger, trägergebundener Arzneiformen in lebende Zellen steht im Mittelpunkt des wissenschaftlichen Interesses in der pharmazeutischen Technologie.
Biomembranen erfüllen viele lebenswichtige Funktionen. Sie dienen nicht nur als Barriere zur Abgrenzung des Zytosols gegen die äußere Umgebung, sondern sind gleichzeitig hoch selektive Filter- und Trägersysteme und haben eine entscheidende Bedeutung bei interzellulären Erkennungsprozessen wie Signaltransduktion, Immunreaktionen und Zelladhäsion. Die funktionelle Vielfalt dieser Systeme wird durch komplexe Strukturen ermöglicht. Dabei bildet die Lipiddoppelschicht die Matrix der Zellmembran. Auf ihrer Außenseite ist eine kohlenhydratreiche Schicht, die Glycocalix, aufgelagert, die die Zelle zu vielfältigen Erkennungsreaktionen befähigt.
In der pharmazeutisch-technologischen Forschung werden Transportvorgänge von Wirkstoffen und Wirkstoffträgersystemen unter definierten Bedingungen in vitro an Zellkulturen untersucht. Durch die Anzucht unterschiedlicher Zelltypen auf permeablen Filtermembranen erhält man physiologisch relevante Modelle für die Darmschleimhaut (Sattler et al., 1997; Bock et al., 1998) oder die Alveolarschleimhaut (Elbert et al., 1999). Dabei geht es keinesfalls nur um die Züchtung der Zellen, sondern um die Nachbildung eines funktionellen Zellverbands. Ausschlaggebend ist hierbei, dass sich zwischen den einzelnen Zellen direkte Verbindungen, so genannte Tight junctions, bilden. Erst dadurch erhalten Zellkulturen den Charakter einer biologischen Barriere und können zur Testung des Transportverhaltens von Arzneistoffen verwendet werden.
Die bioadhäsiven Eigenschaften von Lektinen wurden an Caco-2-Zellkulturen als Modell für die Darmschleimhaut quantifiziert. Dabei wurden Unterschiede zwischen unspezifischer Mucoadhäsion und spezifischer Zytoadhäsion beobachtet. Im Hinblick auf ihr Transportverhalten innerhalb der Zelle unterscheidet man zwei Klassen von Lektinen. Während die N-Acetylgalactosamin-spezifischen Mistellektine nur an der Oberfläche der Zelle binden, werden N-Acetylglucosamin-spezifische Lektine wie WGA, LEA oder UDA (Weizenkeim-, Tomaten- und Brennneseel-Agglutinin) durch einen energieabhängigen Prozess wie die Rezeptor-vermittelte Endocytose in die Zelle aufgenommen.
Das Konzept der Bioinvasion wurde an dem Invasionsmechanismus des Bakteriums Yersinia pseudotuberculosis untersucht, dessen Oberflächenprotein Invasin-Min3 für eine spezifische rezeptorvermittelte Endocytose verantwortlich ist. Invasin-funktionalisierte Nanopartikel werden signifikant besser in Kulturen von MDCK-Zellen aufgenommen, während Caco-2-Zellen offensichtlich keinen Rezeptor aufweisen (Haltner et al., 1997). Partikelgröße und Ligandendichte auf ihrer Oberfläche sind wichtige Faktoren der Internalisierung (Lehr, 2000).
Molekulare Wechselwirkungen im Bild
Die Rasterkraftmikroskopie (Atomic Force Microscopy, AFM) ist eine moderne Methode der Ultrastrukturaufklärung, die 1986 entwickelt wurde (Binnig et al., 1986). In den letzten Jahren wird diese Technik immer häufiger in fast allen Bereichen der Naturwissenschaften verwendet. Neben einer hohen lateralen und vertikalen Auflösung im Nanometer-Bereich bietet sie die Möglichkeit, Proben zerstörungsfrei im Vakuum, an Luft und in unterschiedlichen Flüssigkeiten zu untersuchen. Zusätzlich können mit der Rasterkraftmikroskopie Wechselwirkungskräfte zwischen Messsensor und Oberfläche und damit unterschiedliche physikalische Eigenschaften der Probenoberfläche wie Elastizität, Rauigkeit, molekulare Kräfte und Reibung untersucht und sichtbar gemacht werden (Radmacher, 1997). Gerade in letzter Zeit gewinnt die AFM bei biologischen Fragestellungen immens an Bedeutung.
Besonders wichtig für die biopharmazeutischen Wissenschaften ist die Möglichkeit, biologische Systeme in ihrer nativen Umgebung darzustellen. Erste Untersuchungen galten den biologischen Membranen. Es wurden sowohl Membranmodelle wie Langmuir-Blodgett-Filme (Fritz et al., 1994; Stephens et al., 1996; Bakowsky et al., 1999, 2002), Vesikel (Ohlsson et al., 1995) und Mizellsuspensionen als auch fixierte (Hoh et al., 1991) und lebende Zellen (Butt et al., 1990; Hoh et al., 1991) betrachtet. Durch gezielte Veränderungen der Kräfte zwischen Sensor und Protein konnte die verstärkte Wechselwirkung zwischen beiden Partnern visualisiert werden. Dynamische Techniken wie Tapping Modus (Radmacher et al., 1992) machen „weiche“, elastische Proteine und DNA-Moleküle in nativer Form sichtbar (Oberle et al., 2000).
Die Charakterisierung nanoskaliger Trägersysteme im biologischen Milieu ist aus pharmazeutischer und medizinischer Sicht besonders bedeutend. Auf Grund der hohen Dynamik der Systeme gelingt es noch nicht in jedem Fall, kleine, bewegliche, feste Partikel, Liposomen und adsorbierte oder kovalent gekoppelte Strukturen an deren Oberfläche abzubilden (Bendas et al., 1999). Bei geeigneter Probenpräparation können jedoch mit der Kraftmikroskopie einzelne biologische Moleküle wie Proteine, DNA und Peptide auf sehr kleinen, flexiblen Objekten wie Liposomen oder Polymerpartikeln sichtbar gemacht werden.
Enorme Anstrengungen werden unternommen, um durch ständig verfeinerte Methoden die Kräfte zwischen Rezeptor und Ligand auf Einzelmolekülniveau zu messen und tiefer in die Dynamik des Ausbildens und Lösens von Bindungen beim Erkennungsvorgang einzudringen. Hierbei werden Kräfte zwischen einzelnen Molekülen, die nur einige 10-12 N betragen können, mit hinreichender Genauigkeit unter physiologischen Bedingungen detektiert. Die meisten bisher analysierten Ligand-Rezeptor-Paare wurden an reinen physikalischen Modellen mit sehr starken Bindungskonstanten untersucht. Mit am besten charakterisiert ist das Protein Streptavidin mit seinem Liganden Biotin (Darst et al., 1991; Möhwald et al., 1995; Florin et al., 1994). Mit einer Bindungskonstanten von 1015 Mol-1 und molekularen Bindungskräften von 160 pN ist es eines der am spezifischsten und am stärksten bindenden Ligand-Rezeptor-Paare überhaupt.
Durch Weiterentwicklung der Untersuchungsmethoden gelang es neuerdings, viele molekulare Wechselwirkungen zu charakterisieren. Hier sei exemplarisch hingewiesen auf die Wechselwirkung zwischen komplementären DNA-Strängen (Lee et al., 1994), zwischen DNA und Fibrin (Guthold et al., 1999), intrazellulär zwischen Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) und seinem monoklonalen Antikörper (Willemsen et al., 1999), Fibronektin-3 und IgG (Rief et al., 1998), P-Selektin und Glykoproteinligand 1 (Fritz et al., 1998) sowie zwischen Photolyase und DNA (van Noort et al., 1998).
Diese vornehmlich an isolierten Molekülen in biologischen Modellen vorgenommenen Untersuchungen bilden die Grundlage für erste Versuche, molekulare Adhäsionsprozesse an lebenden Zellen eingehender zu studieren. Die Darstellung von dynamischen Wechselwirkungen an lebenden Objekten ist eine große Herausforderung für die Forschung auf diesem interessanten Gebiet.
Literatur bei den Verfassern
Danksagung: Ein Großteil der dargestellten eigenen Arbeiten wurde von Förderern finanziell unterstützt. Die Autoren danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft, dem Fonds der Deutschen Industrie, dem BMBF+T, der Stiftung Deutscher Naturforscher “Leopoldina”, der Across Barries GmbH, Saarbrücken, der Aesculap AG, Tuttlingen, JPK Instruments, Berlin, und der Surface and Interface Technologies SIT Rosenhof GmbH, Heiligenstadt.
Anschrift der Verfasser:
Professor Dr. Udo Bakowsky
Philipps-Universität Marburg
Institut für Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie
Ketzerbach 63
35037 Marburg
ubakowsky@aol.com
Professor Dr. Claus-Michael Lehr
Universität des Saarlandes
Institut für Biopharmazie und Pharmazeutische Technologie
Fachrichtung 8.6
Im Stadtwald
66123 Saarbrücken
lehr@rz.uni-sb.de
© 2003 GOVI-Verlag
E-Mail: redaktion@govi.de
