PHARMAZEUTISCHE CHEMIE

Wirkstoffgewinnung im Turbotempo

Die rasante Entwicklung der Molekularbiologie – die DNA-Sequenz des menschlichen Genoms ist fast vollständig aufgeklärt – fordert auch die pharmazeutischen Chemiker heraus. Immer schneller werden neue biologische Strukturen entdeckt, die in physiologischen und pathophysiologischen Vorgängen eine wichtige Rolle spielen und damit aussichtsreiche Ziele für eine Therapie darstellen. Die Forscher in der pharmazeutischen Industrie versuchen nun, möglichst schnell Liganden zu finden, die mit diesen neu entdeckten biologischen Strukturen wechselwirken können. Sie gehen dabei aus von der biologischen Zielstruktur oder dem natürlichen Liganden, setzen das High Throughput Screening und die Kombinatorische Chemie ein. Diese Methoden werden im Folgenden vorgestellt.

Angenommen, ein neues biologisches Target (Zielstruktur), beispielsweise ein Enzym oder ein Rezeptor, wird entdeckt, dessen Blockade möglicherweise für die Therapie einer Krankheit von Bedeutung sein könnte. Welche Möglichkeiten gibt es, um möglichst schnell einen Liganden, das heißt einen Inhibitor für das Enzym oder einen Antagonisten für den Rezeptor, zu finden?

Vom biologischen Target zum Inhibitor

Zunächst beschäftigt man sich mit der biologischen Zielstruktur, beispielsweise mit dem neu entdeckten Enzym, um dessen Eigenschaften genauer kennen zu lernen. Zu diesem Zweck muss das Enzym, ein Protein, in größeren Mengen hergestellt werden. Dies erfolgt in der Regel durch gentechnologische Verfahren. Die für das Protein codierende DNA wird mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert und anschließend in Mikroorganismen eingeschleust. Die genetisch veränderten Mikroorganismen werden nun zur Produktion des gewünschten Proteins angeregt, das im nächsten Schritt isoliert und gereinigt wird. Im Idealfall gelingt die Kristallisation des Proteins, und seine dreidimensionale Struktur lässt sich dann durch eine Röntgenstrukturanalyse bestimmen. Die Röntgenstrukturanalyse vermittelt Informationen über den gesamten dreidimensionalen Aufbau des Enzyms, wobei die Struktur des aktiven Zentrums besonders interessant ist.

Im nächsten Schritt wird versucht, Liganden in das aktive Zentrum einzupassen. Dazu bedient man sich der Technik des Molecular Modellings (1, 2). Durch dieses Computer unterstützte Arzneistoff Design (Computer Aided Drug Design; CADD) erhält man erste Vorstellungen, wie ein potenzieller Enzyminhibitor aussehen könnte.

Dieser Enzyminhibitor muss nun synthetisiert und seine tatsächliche biologische Aktivität in einem geeigneten Testsystem geprüft werden. Ausgehend von den Daten der biologischen Aktivität werden nun – wieder mit Hilfe des Molecular Modellings – verbesserte Liganden konzipiert, die wiederum synthetisiert und getestet werden müssen. Bei dieser Vorgehensweise sind zahlreiche Optimierungszyklen nötig, die Synthese-, Testungs- und Molecular-Modelling-Schritte enthalten, bis man den optimierten Liganden erhält. In zunehmendem Maß werden bei diesen Optimierungsschritten frühzeitig biopharmazeutische Aspekte, zum Beispiel Freisetzung, Absorption, Verteilung oder Metabolismus, berücksichtigt.

Ein Beispiel: Die HIV-1-Protease, ein vom HI-Virus codiertes Enzym, spaltet langkettige, von der Wirtszelle produzierte, virale Vorläuferproteine, die unter anderem die Sequenzen der Reversen Transkriptase, der Kapsidproteine und auch der HIV-1-Protease selbst enthalten, in kleinere Proteine, die sich letztlich zu den infektiösen HI-Viruspartikeln zusammenlagern. Die Kristallstruktur der HIV-1-Protease dient als Ausgangspunkt zur Entwicklung nicht-peptidischer HIV-1-Protease-Inhibitoren für die Therapie der HIV-Infektion.

Der körpereigene Ligand als Modell

In einem zweiten Ansatz wird nicht das biologische Target (Enzym oder Rezeptor), sondern das natürliche Substrat der Zielstruktur, also der körpereigene Ligand, als Ausgangspunkt für die Entwicklung neuer Arzneistoffe gewählt. Dazu muss der körpereigene Ligand zunächst identifiziert, isoliert und charakterisiert werden. Ausgehend von dessen Struktur lassen sich mit Hilfe der Molecular-Modelling-Technik neue potenzielle Liganden entwerfen. Daran schließen sich wiederum zahlreiche Optimierungszyklen mit Synthese-, Testungs- und Molecular-Modelling-Schritten an, bis schließlich ein optimierter Ligand resultiert.

Diese Vorgehensweise wird vor allem erfolgreich praktiziert zur Gewinnung nicht-peptidischer Liganden für Rezeptoren, die ein Peptid als physiologisches Substrat binden. Als Beispiel ist hier die Entdeckung selektiver, nicht-peptidischer NPY-Rezeptorantagonisten zu nennen. Beim Neuropeptid Y (NPY) handelt es sich um ein Peptid aus 36 Aminosäuren, das am C-terminalen Ende ein Arginin und ein Tyrosinamid enthält (Arg35-Tyr-NH236). Beim ersten starken und Y1-selektiven NPY-Antagonisten BIBP-3226 ist die Strukturanalogie zum C-terminalen Dipeptid des physiologischen Liganden Neuropeptid Y deutlich zu erkennen. NPY-Antagonisten mit Y1-Selektivität können den Anstieg des Blutdrucks hemmen und bei Tieren die Nahrungsaufnahme reduzieren (4).

Aber auch Bindungspartner für Rezeptoren, die durch nicht-peptidische physiologische Liganden aktiviert werden, lassen sich ausgehend vom körpereigenen Substrat finden. So beschäftigt man sich seit der Entdeckung des körpereigenen Cannabinoid-(CB)-Rezeptorliganden Anandamid intensiv mit Derivaten, die sich von diesem Arachidonsäure-Derivat ableiten. Die Einführung von Methylgruppen mit der richtigen Stereochemie an der Aminkomponente des Carbonsäureamids oder zusätzlich in 2-Stellung der Arachidonsäure führt zu CB1-Rezeptoragonisten wie Methanandamid und Dimethylanandamid, die eine höhere Affinität und Selektivität als der natürliche Ligand aufweisen. Cannabinoid-Rezeptoragonisten sind als potenzielle Arzneistoffe interessant, weil sie einerseits neurogene und periphere Schmerzzustände modulieren können und andererseits in die Glutamat-Transmission eingreifen, wodurch sie neuroprotektiv wirken (5).

Massentest im High Throughput Screening

Seit einiger Zeit wird bei der Wirkstoffsuche ein dritter Weg beschritten, das so genannte High Throughput Screening. Bei diesem Hochdurchsatzscreening handelt es sich um die automatisierte Prüfung einer großen Zahl von Substanzen in einem biologischen Testsystem.

Vor etwa 10 bis 15 Jahren war die biologische Prüfung von Testsubstanzen im Ganztier oder in komplexen pharmakologischen Modellen der geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Wirkstoffsuche. Durch die molekularen Testmodelle mit Enzymen, Rezeptoren, Bakterien, Zellen oder auch Zellbestandteilen zusammen mit der Automatisierung ist die biologische Prüfung von 10 000 und mehr Testsubstanzen pro Tag möglich.

Durch diese Technik des High Throughput Screening stellt die biologische Prüfung heute nicht mehr den Engpass bei der Suche nach neuen Wirkstoffen dar. Im Gegenteil, zur Ausschöpfung der Testkapazitäten versuchen die Firmen, möglichst viele Substanzen aus unterschiedlichen Quellen zu prüfen. Sie greifen dabei zunächst auf den firmeneigenen Substanzpool zurück, der 100 000 und mehr Verbindungen unterschiedlichster Struktur enthalten kann. Zur Erweiterung des Substanzpools werden aber auch Naturstoffe, Pflanzenextrakte, Sekundärmetaboliten aus Bakterien, Pilzen und marinen Organismen oder andere Stoffe in das automatisierte Screening einbezogen. Der Sinn dieser ungezielten Prüfung zahlloser Testverbindungen ist das zufällige Auffinden neuer Leitstrukturen. Hat man eine neue Leitstruktur entdeckt, schließen sich wiederum zahlreiche Optimierungszyklen an, um einen optimierten Liganden zu erhalten.

Durch das Screening von vielen tausend Verbindungen in Rezeptorbindungsstudien wurden die ersten nicht-peptidischen Neurokinin-Rezeptorantagonisten entdeckt. In Abbildung 5 ist oben der prototypische Vertreter der Peptidfamilie der Tachykinine (synonym Neurokinine), das Undecapeptid Substanz P, dargestellt. Unter physiologischen Bedingungen tritt Substanz P mit den Neurokinin-1-(NK1)-Rezeptoren in Wechselwirkung. Verbindungen, die antagonistisch an NK1-Rezeptoren angreifen (NK1-Antagonisten), könnten für die Therapie von Schmerzzuständen, rheumatischen Erkrankungen, Migräne, Erbrechen oder Atemwegserkrankungen interessant sein. Die Entdeckung des ersten nicht-peptidischen NK1-Rezeptorantagonisten CP-96.345 durch Screening einer Vielzahl von Substanzen wurde 1991 von der Firma Pfizer beschrieben (6, 7). Einige Derivate und Analoga dieser Verbindung wurden weiterentwickelt und befinden sich in klinischen Studien.

Substanzvielfalt durch Kombinatorische Chemie

Um die automatisierten Testsysteme beim High Throughput Screening voll auszulasten und um die Vielfalt an Strukturen zu erhöhen, bedient man sich zunehmend der Kombinatorik (8). Darunter versteht man die Darstellung, Untersuchung und/oder Testung einer Vielzahl von Molekülen (100 bis eine Million), die nach dem gleichen Verfahren hergestellt wurden, sich aber in der Art und Anordnung der Bausteine unterscheiden.

Dahinter steckt die Idee, dass sich ein Testsystem aus einem großen Substanzangebot die aktivste Komponente selbst heraussucht. Nach dem gleichen Prinzip funktioniert auch unser menschlicher Körper, bei dem sich Enzyme, Rezeptoren oder Antikörper aus einer Vielzahl von Verbindungen die passenden Substrate auswählen.

Grundsätzlich unterscheidet man bei der kombinatorischen Chemie zwei Prinzipien: die Synthese von Mischungen und die parallele Synthese. Bei der Synthese von Mischungen erfolgt die komplette Synthese in einem Reaktionsgefäß. Beispielsweise wird die an einen festen Träger gebundene Komponente A zunächst mit einem Gemisch der Komponenten B1, B2 und B3 und anschließend mit einem Gemisch der Komponenten C1, C2 und C3 umgesetzt. Auf diese Weise erhält man ein Gemisch aus 3 x 3 gleich 9 Einzelkomponenten, das als "Bibliothek" bezeichnet wird. Allgemein lässt sich die Anzahl der Einzelkomponenten des Gemischs durch Multiplikation der Anzahl der an jeder Position eingesetzten Bausteine ermitteln. Vorteilhaft bei der Synthese von Mischungen ist der geringe apparative Aufwand. Problematisch ist allerdings die Isolierung und Identifizierung der aktiven Komponente(n) einer solchen Bibliothek.

Bei der parallelen Synthese, die in der Regel ebenfalls trägergebunden ausgeführt wird, werden die Einzelkomponenten gleichzeitig, aber in räumlich voneinander getrennten Reaktionsgefäßen hergestellt. Dadurch erhält man so genannte "Arrays" (Reihen) von Verbindungen, deren Struktur auf Grund der gezielten Zugabe der Einzelkomponenten in bestimmte Reaktionsgefäße bekannt ist. Die Technik der parallelen Synthese, die apparativ relativ aufwendig ist, wird durch die Automatisierung mit Syntheserobotern interessant. Die Optimierung und Weiterentwicklung der parallelen Synthese mit Syntheserobotern wird vor allem in den Laboratorien der großen pharmazeutischen Firmen vorangetrieben, weniger zur Entdeckung als vielmehr zur Optimierung von Leitstrukturen.

Ursprünglich wurde das Prinzip der Kombinatorischen Synthese ausschließlich zum Aufbau von Biopolymeren wie Proteinen, DNA, RNA oder Zuckern angewendet. Mittlerweile wird es jedoch immer öfter auch zur Synthese von Bibliotheken und Arrays kleiner, pharmazeutisch interessanter Moleküle eingesetzt; zum Beispiel sind Bibliotheken von Benzodiazepinen und Hydantoinen beschrieben. Von K. C. Nicolaou und Mitarbeitern wurde eine Bibliothek des neuen Zytostatikums Epothilon synthetisiert, wobei im letzten Schritt der Macrozyklus durch eine Ringschluss-Metathese-Reaktion aufgebaut wird und gleichzeitig die Produkte, in Abbildung 7 die Epothilon-Analoga, vom polymeren Träger abgespalten werden (9).

Die rasante Entwicklung der kombinatorischen Chemie wurde ermöglicht durch verbesserte und neue analytische Methoden zur Isolierung und Strukturaufklärung kleinster Substanzmengen. Beispiele sind die Mikrosequenzierung, Codierung mit "tags" (Identifizierungskennzeichen), Dekonvolution (Herleitung der Identität einer Einzelverbindung), chromatographische Methoden wie Hochleistungsflüssig-Chromatographie (HPLC), Gaschromatographie und Kapillarelektrophorese sowie spektroskopische Methoden wie Infrarot-, Kernresonanz- und Massenspektroskopie. Ebenfalls notwendig waren Fortschritte bei der Automatisierung von Synthese und Testung mit Robotern, Automaten und Synthesestraßen sowie die Entwicklung der Datenverarbeitung. Leistungsfähige Computer steuern heute die Syntheseautomaten und das High Throughput Screening, verwalten die Synthese- und Analysendaten, die chemischen und physikalischen Parameter sowie die biologischen Eigenschaften von Tausenden von Substanzen. Diese Daten müssen gesammelt, geordnet, verglichen und bewertet werden (Bioinformatik). Die Grundlage für die kombinatorische Chemie stellt jedoch die Festphasensynthese (10, 11) dar, ohne die eine Automatisierung nicht möglich wäre.

Bei der Festphasensynthese bleiben das gewünschte Produkt und alle Zwischenprodukte während des gesamten Syntheseverlaufs an einen polymeren Träger gebunden. Lösungen der Reagenzien und Reaktionspartner werden in hohem Überschuss zugegeben und nach vollständiger Umsetzung durch Filtration abgetrennt. Während bei der normalen Synthese im Rundkolben nicht-automatisierbare Schritte wie Ausschütteln, Umkristallisieren, Destillieren und Chromatographieren notwendig sind, lässt sich die Festphasensynthese leicht mit Syntheseautomaten durchführen, da zur Reinigung nur filtriert werden muss. Zudem kann man durch einen hohen Überschuss der Reaktionspartner einen nahezu quantitativen Umsatz erreichen. Dieses Reaktionsprinzip wurde 1963 von Robert B. Merrifield zur Peptidsynthese eingeführt. Für diese revolutionäre Idee wurde er 1984 mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet.

Prinzipiell wird bei der Festphasensynthese eine Ankergruppe an einen polymeren Träger, der als Harz bezeichnet wird, angeknüpft. Dieses Harz muss mechanisch stabil, chemisch inert und in den bei der Festphasensynthese gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln unlöslich, aber gut quellfähig sein. Häufig eingesetzt wird ein Polystyrolharz, das mit etwa 1 Prozent Divinylbenzol quervernetzt ist. An die Ankergruppe des Harzes wird der erste Synthesebaustein angeknüpft, der dann, eventuell nach Modifizierung (zum Beispiel Schutzgruppenabspaltung) mit dem nächsten Baustein verbunden wird. Nach abgeschlossener Synthesesequenz wird das fertige Produkt vom Anker gelöst und isoliert.

Im Unterschied zu Umsetzungen in Lösung erfolgen hier die Reaktionen in heterogener Phase (unlösliches Harz suspendiert im Reaktionsmedium). Die Reaktionsgeschwindigkeit wird dabei durch die Diffusion der Reaktionspartner und Reagenzien in die Poren des Harzes, wo die Substrate gebunden sind, bestimmt. Deshalb stellt die Quellfähigkeit der Harze einen wichtigen Parameter dar. Zur erfolgreichen Realisierung von Synthesen an fester Phase ist die Entwicklung eigener Strategien erforderlich, die die Chemie der Ankergruppen, der Schutzgruppen, der Bausteinverknüpfungen sowie der Umsetzungen am Polymer berücksichtigen.

Die Festphasensynthese lässt sich zum Aufbau von Polymeren, zum Beispiel Peptiden, anwenden. In zunehmendem Maße werden auch kleine organische Moleküle an fester Phase dargestellt. Beispiel: die Festphasensynthese eines Nifedipin analogen Dihydropyridins nach Hantzsch. Über mehrere Schritte wird eine Acetessigester-Komponente an einem festen Träger angeknüpft. Wie bei der Synthese in Lösung lässt sich auch der polymergebundene Acetessigester mit Benzaldehyd und Methyl-aminocrotonat nach Hantzsch zum Dihydropyridin kondensieren. Nach Reinigung des harzgebundenen Reaktionsprodukts mit Hydrazin lässt sich das Dihydropyridin mit Trifluoressigsäure abspalten. Durch Verwendung von Gemischen aus substituierten Benzaldehyden und Alkyl-aminocrotonaten gelingt nach diesem Prinzip der Aufbau einer Bibliothek aus 272 Dihydropyridinen (12).

Die modernen automatisierten Synthesestrategien haben die Entwicklungszeit für neue Arzneistoffe drastisch verkürzt und werden von der pharmazeutischen Industrie stetig weiter verfeinert. Zahlreiche neue Leitstrukturen und optimierte Liganden konnten so in relativ kurzer Zeit dargestellt werden. Klinische Prüfungen werden jetzt zeigen, welche therapeutischen Verbesserungen mit diesen Wirkstoffen erreicht werden können.

Literatur

(1) Höltje, H.-D., Folkers, G., Molecular Modeling – Basic Principles and Applications. VCH-Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, New York, Basel, Cambridge, Tokyo 1996.
(2) van de Waterbeemd, H., Testa, B., Folkers, G., Computer Assisted Lead Structure Finding and Optimization – Current Tools for Medicinal Chemistry. Wiley VCH-Verlag, Weinheim, New York, Chichester, Brisbane, Singapore, Toronto 1997.
(3) Gubernator, K., Böhm, H.-J., Structure-based Ligand Design – Methods and Principles in Medicinal Chemistry. Wiley VCH-Verlag, Weinheim, New York, Chichester, Brisbane, Singapore, Toronto 1998.
(4) Buschauer, A., Bernhardt, G., Dove, S., NPY-Rezeptoren als Zielstrukturen für neue Arzneistoffe. Pharm. Ztg. 145 (2000) 1956 - 1962.
(5) Piomelli, D., et al., The endocannabinoid system as a target for therapeutic drugs. Trends Pharmacol. Sci. 21 (2000) 218 - 224.
(6) Longmore, J., Swain, C. J., Hill, R. G., Neurokinin Receptors. Drug News and Perspectives (1995) 5 - 23.
(7) Gerspacher, M., von Sprecher, A., Dual neurokinin NK1/NK2 receptor antagonists. Drug. Fut. 24 (1999) 883 - 892.
(8) Beck-Sickinger, A. G., Weber, P., Kombinatorische Methoden in Chemie und Biologie. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin 1999.
(9) Nicolaou, K. C., et al., Gezielt entworfene Epothilone: Kombinatorische Synthese, Induktion der Tubulin-Polymerisation und cytotoxische Wirkung gegen taxolresistente Tumorzellen. Angew. Chem. 109 (1997) 2181 - 2187.
(10) Dorwald, F. Z., Organic Synthesis on Solid Phase. Wiley VCH-Verlag, Weinheim, New York, Chichester, Brisbane, Singapore, Toronto 2000.
(11) Burgess, K., Solid Phase Organic Synthesis. John Wiley & Sons, Weinheim, New York, Chichester, Brisbane, Singapore, Toronto 2000.
(12) Breitenbucher, J. G., Figliozzi, G., Solid-phase synthesis of 4-aryl-1,4-dihydropyridines via the Hantzsch three component condensation. Tetrahedron Lett. 41 (2000) 4311 - 4315.

Einen Vortrag über die modernen Methoden der Wirkstoffgewinnung hielt Professor Wünsch am 21. Juli 2000 im Rahmen des Baden-Württembergischen Apothekertages in Freiburg.

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