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Genomics und Proteomics mit Gen-Chips und Protein-Arrays

30.07.2001  00:00 Uhr

IM ZEITALTER DER "OMICS"

Genomics und Proteomics mit Gen-Chips und Protein-Arrays

von Diethard Baron, Penzberg

Der Mörder ist immer der Gärtner. Um dies eindeutig beweisen zu können, verließ sich Sherlock Holmes noch auf den klassischen Fingerabdruck. Heute wird zunehmend der genetische Fingerabdruck herangezogen, eine extrem zuverlässige und sensitive Methode. Die Analyse von DNA gehört seit mehreren Jahren zum Alltag, nicht nur in der Gerichtsmedizin zur Identifizierung von Tätern, sondern auch in der Nahrungsmittelindustrie zum Aufspüren von Produkten aus gentechnisch veränderten Organismen (GVO), in der Umweltanalyse zum Nachweis von Mikroorganismen, in der klinischen Diagnostik zur Identifizierung von Erregern oder zur Bestimmung von Resistenzen gegen Medikamente, in der Evolutionsbiologie zur Feststellung von Verwandtschaften und in der Archäologie zur Identifizierung von fossilen Funden.

Unabhängig von der Anwendung müssen die Analyseverfahren immer die gleichen Anforderungen erfüllen: möglichst schnell, billig, empfindlich, zuverlässig und reproduzierbar sein. So werden Firmen und Universitäten immer wieder gefordert, bestehende Methoden zu optimieren und neue Technologien zu etablieren, um den ständig steigenden Ansprüchen der Praxis gerecht zu werden. So war auch der vorzeitige Abschluss des humanen Genomprojektes auf die Entwicklung schnellerer und empfindlicherer DNA-Sequenzierautomaten zurückzuführen.

Die Gen-Chips, auch DNA-Arrays genannt, repräsentieren einen weiteren Meilenstein in der DNA-Analyse. Mit ihrer Hilfe kann die DNA-Bestimmung enorm beschleunigt, parallelisiert, automatisiert, vereinfacht und präzisiert werden. Die Soft- und Hardware ist bereits kommerziell erhältlich, und zwölf unterschiedliche Chips werden vorzugsweise in der klinischen Diagnostik von Infektions-, Krebs- und Erbkrankheiten eingesetzt (9). Weltweit sind mehr als achtzig Firmen unmittelbar an der Entwicklung und Vermarktung von dazugehörigen Geräten, Gerätekomponenten, Reagenzien und Computerprogrammen beteiligt. Erfreulicherweise sind auch mehrere deutsche Firmen involviert wie Biochip Technologie GmbH in Freiburg, Clondiag Chips Technologies in Jena oder das Fraunhofer-Institut für Silizium-Technologie in Itzehoe. Der Weltjahresumsatz mit Gen-Chips betrug im letzten Jahr 2,3 Millionen US-Dollar und wird in 2005 schätzungsweise 6 Milliarden US-Dollar erreichen.

DNA-Träger im Miniformat

Die allgemeingültige Definition eines Gen-Chips lautet: DNA-Chips oder DNA-Arrays sind miniaturisierte Träger, auf deren Oberfläche DNA-Moleküle bekannter Sequenz in einem geordneten Raster immobilisiert oder synthetisiert sind. Die gebundenen DNA-Moleküle werden mit komplementären markierten Nukleinsäuren hybridisiert (1).

Die Gen-Chip-Technologie verlangt die synergistische Kooperation von Biologen, Biotechnologie-Ingenieuren, Chemikern, Computerwissenschaftlern, Medizinern und Physikern. Ein Reihe von Spezialdisziplinen müssen zum Gelingen des Chip-Prinzips kombiniert werden wie DNA-Synthese, Oligonukleotid-Synthese, Synthese und Neuentwicklung von Fluoreszenzfarbstoffen, Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen, Oligonukleotid-Immobilisierung, Festphasentechnik, Lasertechnologie für Detektionssysteme, Chip und Wafer-Herstellung, Geräteentwicklung, Datenanalyse mit geeigneter Software inklusive der Entwicklung geeigneter Genfindungs-Algorithmen (www.dechema.de/chips).

Die Tabelle zeigt die aktuellen Anwendungsmöglichkeiten von DNA-Chips in Therapie, Diagnostik, Pharmazie, Produktion, Ernährung und Ökologie (2, 11).

 

Tabelle: Anwendungsmöglichkeiten von DNA-Chips

Anwendungsbereich

Zielsetzung

Medikamentenentwicklung

Gezieltes und schnelles Medikamentendesign

Pharmakologie
Pharmakokinetik

Molekulares Verstehen von Medikamentenwirkung und Nebenwirkung

Qualitätskontrolle

Reinheitsnachweis von synthetischen Oligonukleotiden und Genen

In-Prozess-Kontrolle

Genetische Veränderungen bei normalen und rekombinanten Zellen während der Fermentationen

Diagnostik

Identifizierung von Erregern 
Bestimmung von Medikamentenresistenz

Krebsforschung

Identifizierung von Krankheitsgenen 
Bestimmung des individuellen Krebsrisikos

Mikrobiologie

Identifizierung und Klassifizierung von Mikroorganismen

Nahrungsmittelsektor

Identifizierung von gentechnisch veränderten Nahrungsmitteln

Pflanzenzüchtung

Molekulare Marker für Pflanzenkreuzungen

Ökologische Studien

Mikrobielle Kontamination von Grundwasser oder Böden

Differenzielle Genexpression

Verstehen von Zellspezialisierung und Zellentartung

 

Wie entsteht ein Gen-Chip?

Prinzipiell bieten sich zwei Herstellungsverfahren an: die schrittweise Synthese von Nukleotiden auf der Chip-Oberfläche oder die Anheftung eines fertigen Stücks Nukleinsäure. Im ersten Fall erhält man "Oligo-Chips", deren gekoppelte Oligonukleotide eine Länge von 10 bis 30 Basen haben, im zweiten Fall so genannte "DNA-Chips", auf denen Genfragmente oder cDNA's mit einer Länge von einigen 100 Basen befestigt werden (16). Die beiden Typen werden in der Praxis kaum scharf unterschieden, der Ausdruck Gen-Chip gilt oft für beide.

Mit mehreren Techniken kann man Nukleinsäuren an einen festen Träger binden (zu physikalischen und chemischen Details dieser Methoden siehe Literatur [3]). Als feste Träger dienen Glas, Silizium, Polymere (Nylon) oder Metall. Der Preis eines Chips, der vorwiegend als Einmalartikel anzusehen ist, variiert von 10 bis 1000 US-Dollar. Die einzelnen Fertigungsverfahren unterscheiden sich vor allem in Menge und Dichte der DNA-Spots. Spitzenwerte liegen bei mehr als einer Millionen immobilisierter Oligonukleotide pro cm² Chip.

Die erste Gen-Chip-Firma namens Affymetrix wurde 1990 in den USA gegründet. Die Bezeichnung GeneChip® wurde von ihr rechtlich geschützt. Die Firma GeneScan Europe AG (www.genescan-europe.de) hat vor wenigen Monaten in Freiburg die weltweit erste Massenproduktionsanlage für Biochips installiert (25). Der Durchbruch gelang durch die Entwicklung neuartiger Dispensier- und Kopplungstechnologien (Polymerbürstentechnik), mit der die Kopplungsdichte von unterschiedlichen Biomolekülen (Nukleinsäuren, Peptide, Proteine) vervielfacht werden konnte (5). Mehrere Firmen stellen auch maßgeschneiderte Chips nach Kundenwünschen her.

Photolithographie und virtuelle Lochmasken

Die älteste und gebräuchlichste Methode zur Chip-Herstellung ist die Photolithographie; sie wurde 1991 von Affymetrix erstmals erfolgreich eingesetzt (7, 10) und beruht auf einer lichtvermittelten, kombinatorischen Festphasenchemie.

Die Oberfläche des Chips ist mit einem photoempfindlichen Material beschichtet, das durch Bestrahlung aktiviert wird und Nukleotide kovalent binden kann (6). Damit die Nukleotide nur an genau festgelegten Positionen gebunden werden, wird über den Chip eine Lochmaske mit einem definierten Lochmuster gelegt. Nach der strahleninduzierten Aktivierung der Chipoberfläche werden (in diesem Beispiel) Adenin-Nukleotide zugegeben, die nur an den aktivierten Positionen chemisch gekoppelt werden. Die Adenin-Nukleotide sind ihrerseits chemisch voraktiviert, was durch den kleinen Kreis am A symbolisiert wird. Beim zweiten Schritt wird eine neue Lochmaske mit einem anderen Lochmuster verwendet, so dass andere Stellen der Chipoberfläche photochemisch aktiviert werden. Nach Zugabe der chemisch voraktivierten Cytidin-Nukleotide werden diese sowohl direkt an die aktivierten Positionen auf dem Chip als auch an die bereits voraktivierten Positionen der Adenin-Nukleotide gebunden. So liegen dann bereits Dinukleotide vor. Im dritten Schritt wird wieder eine andere Lochmaske verwendet und ein aktiviertes Guanin-Nukleotid zugegeben, was zu definierten Mono-, Di- und Trinukleotiden mit bekannter Sequenz führt. Diese Einzelschritte werden bis zu 20 Mal wiederholt, so dass letztlich eine Vielzahl unterschiedlicher Oligonukleotide auf dem Chip vorliegt. Die den Herstellprozess steuernde Software "weiß" natürlich genau, an welcher Stelle welches Oligonukleotid mit welcher Basenabfolge (Sequenz) sitzt.

Eine Weiterentwicklung dieses photolithographischen Prinzips ist die virtuelle Lochmaske, bei der 480.000 einzeln ansteuerbare Mikrospiegel eine lichtaktivierbare Oberflächenbeschichtung an frei wählbaren Positionen punktgenau aktivieren können (4).

 

PCR vermehrt DNA-Stücke Die PCR (Polymerase Chain Reaction, Polymerasekettenreaktion) ist eine automatisierte Methode zur identischen Vervielfältigung von DNA. Mit konventionellen Geräten kann ein DNA-Stück in zwei Stunden eine Milliarde Mal vervielfältigt werden, mit den modernsten Geräten (Thermocycler) dauert das etwa 20 Minuten. In einem Reaktionsansatz können maximal sieben unterschiedliche DNA-Stücke nebeneinander vermehrt werden (Multiplex PCR). Bei eukaryontischen Genen geht man von der reifen mRNA aus. Durch die RT-PCR, einer Kombination von Reverser Transkription und PCR, werden die zur mRNA passenden DNA-Abschnitte vervielfältigt.

 

Inkjet-Printing: DNA statt Tinte

Die ebenfalls weit verbreitete Methode des Inkjet-Printing basiert auf dem jedem PC-Benutzer bekannten Prinzip des Tintenstrahldruckers, bei dem kleine Flüssigkeitströpfchen unter Verwendung des piezoelektrischen Effekts auf eine Oberfläche gespottet werden. Winzige DNA-enthaltene Mikrotröpfchen von weniger als 100 Picoliter (ein Picoliter = 10-12 Liter) bis maximal drei Mikroliter werden dabei mit hoher Präzision verteilt. Als feste Träger wird gerne der klassische mikroskopische Objektträger herangezogen. Modernste Geräte können darauf bis zu 15.000 Miniatur-Spots mit einem Durchmesser von weniger als 100 µm auftragen (8).

Noch besser dosierbar und präziser sind die Capillary Tube Technologie, bei der die DNA-Proben über Kapillarkräfte eingesaugt werden, und das Titanium Pin Prinzip, bei dem die DNA-Lösung auf einer konkaven Pin-Oberfläche festgehalten und transferiert wird.

Mutationsanalyse des Brustkrebsgens

Wie eine Gen-Chip unterstützte DNA-Diagnostik abläuft, soll anhand der Mutationsanalyse des Brustkrebsgens BRCA-1 erläutert werden. Bisher wurden zwei Gene identifiziert, BRCA-1 und BRCA-2 (BRCA = breast cancer, Brustkrebs), die mit einem erhöhten individuellen Brustkrebsrisiko in Verbindung gebracht werden können, sobald bestimmte Bereiche im Gen mutiert sind.

Die von den beiden Genen codierten Proteine gehören zur Klasse der Reparaturenzyme, die für die Reparatur von Mutationen zuständig sind. Pro Tag ereignen sich schätzungsweise 10.000 Mutationen im menschlichen Genom, hauptsächlich Punktmutationen, die durch die Veränderung einer Base charakterisiert sind. Diese können an der Auslösung von Krebserkrankungen beteiligt sein. Beim BRCA-1 entscheidet nur ein kleiner Teilabschnitt von zwölf Basen über die Enzymfunktion. Treten dort Mutationen auf, ist das Enzym sehr stark geschädigt oder inaktiv und kann seine Reparaturaufgaben nicht mehr ausreichend wahrnehmen.

Diese zwölf Basen haben vom 5'-Ende aus gelesen im nicht-mutierten Zustand die Sequenz GAGCAGTCGACG. Auf dem Gen-Chip sind zur Erfassung der möglichen Mutationen 96.000 Oligonukleotide (auch als Sonden bezeichnet) mit einer Länge von zwölf Nukleotiden fixiert. Die Analyse läuft folgendermaßen ab (6):

  • Vom Patienten wird Blut oder eine Gewebeprobe entnommen.
  • Die gesamte genomische DNA oder mRNA wird isoliert.
  • Die relevante Zielsequenz wird mit Hilfe der PCR oder RT-PCR etwa eine Millionen Mal vervielfältigt, wobei der Reaktionsansatz ein fluoreszenzmarkiertes Nukleotid enthält. Damit werden die vervielfältigen DNA-Abschnitte fluoreszenzmarkiert; nach erfolgter Reaktion auf dem Chip können sie fluoreszenzoptisch detektiert werden.
  • Der gesamte PCR-Ansatz wird auf dem Chip auftragen.
  • Passende DNA-Sequenzen hybridisieren mit komplementären Sonden auf dem Chip.
  • Mit Hilfe eines Laserscanner wird der Chip abgerastert und die mögliche Fluoreszenz in jedem Feld erfasst.

Ist eine Mutation eingetreten, hybridisiert die Patienten-DNA mit einer zur Mutation passenden Sonde auf der Chipoberfläche. Dies ermöglicht eine genaue Identifizierung der eingetretenen Mutation, also welche Base an welcher Stelle verändert ist. Damit kann mit der Chip-Methode auch die Sequenz bestimmt werden, was als "Sequenzierung durch Hybridisierung" bezeichnet wird.

Der kommerziell angebotene Chip hat eine Trefferquote von über 95 Prozent. Er beinhaltet eine Positiv-Kontrolle in Form eines "housekeeping"-Gens, um den Testerfolg und das Funktionieren des Chips überprüfen zu können. "Housekeeping"-Gene werden permanent abgelesen und codieren für Proteine, die für das (Über)leben der Zelle immer vorliegen müssen, beispielsweise Enzyme der Glycolyse (Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase), Proteine des Zellskeletts (Beta-Actin) oder DNA-gebundene Proteine (Histon 3a).

 

Vier Typen von RNA In höheren Organismen kommen immer vier Typen an Ribonukleinsäuren vor: mRNA (messenger RNA), tRNA (Transfer-RNA), rRNA (ribosomale RNA) und kleine nukleäre RNA (snRNA, small nuclear RNA). Die mRNA ist die "Abschrift" (Transkript) der DNA-Information, die dann an den Ribosomen in Proteine übersetzt wird (Translation). Die tRNA ist das "Aminosäure-Taxi", das die für die Neubildung von Proteinen benötigten Aminosäuren heranschafft. Die rRNA ist Bestandteil der Ribosomen und damit ebenfalls an der Proteinsynthese beteiligt. Die snRNA wird für das Spleißen der unreifen mRNA benötigt. Die Information für die Struktur von rRNA, tRNA und snRNA ist ebenfalls auf der DNA festgelegt. Gene kodieren also nicht nur für Proteine, sondern auch für RNA.

 

Genotypisierung von Mycobakterien

Etwa achtzig Spezies und Subspezies von Mycobakterien wurden bisher identifiziert. Zehn Spezies führen beim Menschen zu schweren und langwierigen Krankheiten wie

  • Tuberkulose durch M. tuberculosis, M. bovis und M. africanum,
  • Befall von Lunge, Lymphknoten, Unterhautfettgewebe, Haut und Gelenke durch M. xenopi und M. kansasii oder
  • generalisierte Infektionen bei AIDS-Patienten mit M. avium und M. intracellulare.

Der konventionelle Nachweis mittels Bakterien-Kultivierung dauert drei bis vier Wochen, der Nachweis mit dem GeneChip® dagegen nur vier bis fünf Stunden. Ziel dieser Diagnostik ist die Identifizierung der auslösenden Mycobakterien-Spezies und der Nachweis von Resistenzen gegenüber Rifampicin, dem Standard-Antibiotikum gegen Mycobakterien. Zur Bestimmung beider Parameter werden zwei unterschiedliche Chips angeboten (12).

Auf dem Chip, mit dem die Identifizierung der Spezies erfolgt, sind Oligonukleotid-Sonden gegen polymorphe Bereiche des 16S-rRNA-Gens gekoppelt. Auf dem zweiten Gen-Chip, mit dem Resistenzen gegenüber Rifampicin erfasst werden, sind Oligonukleotid-Sonden gegen das RNA-Polymerase-Gen (rpoB) gekoppelt, bei dem mehrere Mutationen in bekannten Positionen für etwa 90 Prozent der Rifampicin-Resistenzen verantwortlich sind. Insgesamt können siebzig Mycobakterien-Stämme inclusive 27 klinisch relevanten Spezies sowie 15 unterschiedliche Rifampicin-resistente Stämme erfasst werden. Die Erfolgsrate liegt bei 100 Prozent (alain_treosch@affymetrix.com). Die Diagnostik läuft in mehreren Schritten wie oben beschrieben ab.

Resistenten HI-Viren auf der Spur

Mit einem DNA-Chip kann die Resistenz gegen mehrere Medikamente nachgewiesen werden. Das Ziel ist die möglichst rasche Erfassung von Mutationen und damit ein möglichst früher Medikamentenwechsel, noch bevor sich die Krankheit bei dem Patienten verschlechtert, wodurch bisher eine Resistenz erkannt wurde. Eines der größten Probleme der Therapie liegt in der raschen Resistenzentwicklung der mehr als 4000 identifizierten HIV-1-Subtypen. Diese Resistenzentwicklung ist hauptsächlich in der vergleichsweise hohen Fehlerrate der Reversen Transkriptase begründet. Um dieses Problem einigermaßen beherrschen zu können, wird heute routinemäßig eine Kombinationstherapie aus drei bis vier antiviralen Medikamenten - Hemmstoffen der Reversen Transkriptase und der Protease - angewendet.

Die DNA-Chip-Diagnostik erfolgt wieder in mehreren Schritten: Aus einer Blutprobe wird zunächst Virus isoliert. Mit der PCR werden relevante Genabschnitte der Reversen Transkriptase und Protease, in denen für die Resistenz verantwortliche Mutationen auftreten, identisch vervielfältigt. Zugleich werden fluoreszenzmarkierte Nukleotide in die vervielfältigte DNA eingebaut. Nach Zugabe des PCR-Ansatzes zum GeneChip® hybridisiert die vervielfältigte DNA mit spezifischen Sonden auf dem Chip. Das Fluoreszenzmuster wird anschließend mit einem Laserscanner ausgewertet.

 

Introns und Exons Die Gene von Prokaryonten (Organismen ohne Zellkern, meistens Bakterien) bestehen nur aus "wichtiger" Information, die später in den Proteinen wiederzufinden ist. Die für Proteine kodierenden Gene von Eukaryonten (Organismen mit Zellkern, also Hefezellen, Pflanzenzellen, tierische und menschliche Zellen) zeigen eine Mosaikstruktur und bestehen aus Exons und Introns. Die Information der Exons ist in den Proteinen wiederzufinden, die Information der Introns nicht. Bei der Transkription der DNA entsteht eine unreife mRNA, die noch Exons und Introns enthält. Durch einen Schneidemechanismus, Spleißen genannt, werden die intronischen Bereiche herausgeschnitten, so dass die reife mRNA nur noch exonische Information enthält, die dann in ein oder mehrere Proteine übersetzt wird. Introns sind etwa 30 bis 40 Mal länger als Exons.

 

SNP, der kleine Unterschied

Geradezu unschlagbar und unverzichtbar ist die DNA-Chip-Technologie bei der SNP-Analyse (www.genengnews.com). SNP steht für "single nucleotide polymorphism", das heißt für Variationen einer Base. Nicht zuletzt durch die Erkenntnisse des Humanen Genomprojekts wurde offenbar, dass das Genom bei allen Menschen zu 99,9 Prozent identisch ist. Für die genetischen Unterschiede von Mensch zu Mensch sind die restlichen 0.1 Prozent verantwortlich. Schon der Austausch einer einzigen Base reicht aus, um Unterschiede genetisch festzulegen. In etwa zwei Drittel der Fälle ist die Base Cytosin durch Thymin ersetzt. Übrigens beträgt die DNA-Sequenz-Identität zwischen Mensch und Schimpanse, Gorilla und Orang-Utan 98,5 Prozent.

Da SNP's durchschnittlich alle 500 bis 1000 Basenpaare vorkommen und das menschliche Genom aus etwa 3,4 Milliarden Basenpaaren besteht, ergeben sich drei bis sechs Millionen SNP's. Sie sind in Introns und Exons vorhanden. SNP's sind für die Diagnostik und Therapie gleichermaßen interessant, da sie Krankheitsneigung und Medikamentenwirkung steuern (18). Etwa zehn Prozent aller Erkrankungen beruhen auf SNP's. Dazu einige Beispiele:

  • SNP im ApoE4-Allel ist mit einem erhöhten Risiko für Morbus Alzheimer assoziiert.
  • SNP im Blutgerinnungsfaktor V (Faktor-V-Leiden) führt zu einem fünffach erhöhten Risiko für Blutgerinnselbildung.
  • SNP in dem zellulären Adhäsionsprotein ICAM-1 steigert das Risiko für entzündliche Darmerkrankungen.
  • 49 SNP's wurden für das Cytochrom P450-Gen beschrieben, das maßgeblich am Abbau von einem Viertel aller Medikamente beteiligt ist. Damit können individuelle Unterschiede in der Medikamentenwirkung sowie im Auftreten von Nebenwirkungen und Unverträglichkeiten molekular erklärt werden. Diese Erkenntnisse sollen zu einer patientengruppenspezifischen Entwicklung von Medikamenten führen (19).

Ein internationales SNP-Konsortium, das aus zehn großen Pharmafirmen besteht und über ein Budget von 45 Millionen US-Dollar verfügt, will in den nächsten zwei Jahren 300.000 SNP's identifizieren sowie 150.000 SNP's lokalisieren und kartieren. Weiterhin sollen 5,3 Millionen individuelle SNP's in ethnisch verschiedenen Gruppen sequenziert und krankheitsspezifische SNP-Muster identifiziert werden. Die Daten sollen im Internet für jedermann frei zugänglich sein (14).

 

MALDI-TOF: Moleküle im Flug Protein- und DNA-Fragmente können an Hand ihres Molekulargewichts genau identifiziert werden. Die zur Zeit modernste und empfindlichste Technik ist die MALDI-TOF-MS (Matrix-assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry). Die zu untersuchende Probe wird durch Laserbeschuss in geladene Moleküle überführt, die in einem luftleeren Rohr mittels Ringelektroden beschleunigt werden. Am Ende des 60 cm bis 2 m langen Flugrohrs werden die ankommenden DNA- oder Proteinmoleküle detektiert. Die zurückgelegte Flugzeit, die sich im Mikro- bis Millisekundenbereich bewegt, ist proportional zur Quadratwurzel des Molekulargewichts.

 

Um diese immense Aufgabe bewältigen zu können, sollen Gen-Chips eingesetzt werden, auf denen sowohl das komplette Genom, aufgeteilt in überlappende Abschnitte von kurzen DNA-Abschnitten, als auch relevante humane Genabschnitte gekoppelt vorliegen. Die dafür benötigten Techniken sind weitgehend vorhanden (15). Ein Hauptproblem bei der SNP-Bestimmung besteht in der raschen Analyse der gebundenen DNA-Stücke. Die modernste Technologie, die von der Firma Sequenom Industrial Genomics (USA) unter den Namen MassARRAY® und SpectroCHIP® angeboten wird, kann mittels ausgeklügelter DNA-Vervielfältigungsmethodik und Flugzeitmassenspektroskopie (MALDI-TOF) 3840 Auswertungen in vier Stunden vornehmen; das sind weniger als vier Sekunden pro Probe.

 

Komplementäre DNA und RNA Auf Grund der Mosaikstruktur eukaryontischer Gene können Gene nicht direkt aus der DNA isoliert werden, weil dabei auch intronische Sequenzen erhalten werden, die für die Proteine keinen Beitrag leisten. Es ist nur ein indirekter Weg möglich: Reife mRNA wird aus der Zelle isoliert und mit der Reversen Transkriptase in DNA zurückübersetzt. Die so erhaltene DNA wird cDNA genannt (copy DNA oder complementäre DNA). Die cDNA kann für Markierungsstudien oder für die Hybridisierung mit DNA wieder in RNA zurückübersetzt werden, die dann cRNA genannt wird.

 

DNA-Chips in großer Vielfalt

Bei mehr als sechzig Prozent aller menschlichen Tumorerkrankungen liegen Mutationen im Tumorsuppressor-Gen p53 vor, mehr als fünfzig Mutationen sind beschrieben. DNA-Chips helfen bei der Identifizierung von Mutationen; die Testempfindlichkeit liegt bei einer Tumorzelle in 10. 000 Normalzellen.

Ein Nutri-Chip-System soll zum Nachweis von pathogenen Mikroorganismen in Nahrungsmitteln eingesetzt werden. Ein spezieller Chip, der sich noch in der Entwicklung befindet, eignet sich für den Nachweis von gentechnisch veränderten Organismen (GVO). Acht unterschiedliche Gensequenzen können auf einem GVO-Chip parallel erfasst werden.

Der Hämatochromatose-Chip dient der raschen und eindeutigen Diagnose dieser weit verbreiteten Krankheit. Drei Punktmutationen im Hämatochromatose-Gen spielen eine entscheidende Rolle. Die Patienten leiden an einer krankhaft erhöhten Eisenresorption und einem Eisenüberschuss, der zu Multiorgan-Dysfunktionen wie Leberzirrhose, Diabetes, Arthritis, Kardiomyopathien mit Herzversagen und Arrhythmien führt. Der zur Zeit gebräuchliche Mutationsnachweis mittels PCR und RFLP ist aufwändig. Mit dem DNA-Chip können alle drei Mutationen in einem Ansatz detektiert werden (5).

Das HLA-System (HLA: human leucocyte antigen) repräsentiert das am meisten polymorphe System im gesamten menschlichen Genom. Probleme entstehen dadurch zum Beispiel bei der Suche nach optimalen Spender-Empfänger-Kombinationen bei der Organtransplantation. Eine wesentliche Verbesserung erhofft man sich durch eine HLA-Genotypisierung mit Hilfe von DNA-Microarrays (17).

Verschiedene Firmen arbeiten an der Entwicklung von Chips für die Diagnose von Viren, Blutvergiftung, Tumoren, Autoimmunkrankheiten und Magen-, Darm-, HNO- und Atemwegsinfektionen.

Die Gen-Chips gehören heute zum methodischen Repertoire der Disziplin übergreifenden Biowissenschaften oder Life Sciences. So darf man diese neue Methodik nicht isoliert betrachten. Ein umfassendes Verständnis von Lebensprozessen ist nur durch die Einbeziehung ergänzender Methoden erreichbar. Auch hier sind die beherrschenden Schlagworte Miniaturisierung, Parallelisierung und Hochdurchsatz. Erst die Kombination von Genanalyse (Genomics), mRNA-Analyse (Transcriptomics), Proteinanalyse (Proteomics), Glycosylierungsanalyse (Glycomics) und Analyse von niedermolekularen Zellmetaboliten (Metabolomics) führt zum umfassenden Verständnis der Biologie des Menschen im gesunden und kranken Zustand. Es lebe das Zeitalter der "Omics".

Proteinfunktionen besser verstehen

Bei aller Euphorie sollte man nicht vergessen, dass Gene "nur" Bauanleitungen für Proteine darstellen, dass jedoch der Körper vorwiegend aus Proteinen aufgebaut ist und diese vielfältige Aufgaben erfüllen (20). Für die genaue Diagnose von Krankheiten, für das Verständnis von Medikamentenwirkung und Nebenwirkung sowie für die Entwicklung neuer Medikamente führt kein Weg an den Proteinen vorbei (25). Im Menschen gibt es schätzungsweise zwischen 100.000 bis 1 Million unterschiedliche Proteine, die von nur 35.000 bis 50.000 Genen codiert werden, wie neueste Ergebnisse des humanen Genomprojektes zeigen. Nur etwa drei Prozent der gesamten DNA kodieren für Proteine (13).

Bei den Protein-Arrays sind, analog zu den Gen-Chips, Proteine oder Peptide auf Kunststoffmembranen in einem geordneten und bekannten Raster angeordnet. Gemessen wird die wechselseitige Bindung von Proteinen, zum Beispiel Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen, intrazelluläre Proteinkomplexe, DNA-Protein- und RNA-Protein-Wechselwirkung oder Protein-Antikörper-Interaktionen zur Proteinidentifizierung (23).

Im Zytoplasma und anderen Zellkompartimenten sind funktionell zusammengehörende Proteine, beispielsweise die von Stoffwechselwegen, zu supramolekularen Proteinkomplexen zusammengefasst. Sie zu verstehen und krankheitsassoziierte Veränderungen aufzuzeigen, ist ein großes Ziel der Protein-Chip-Technologie. Diese neue Disziplin innerhalb der Protein-Analytik wird auch "Functional Genomics" genannt. Ein weiteres Ziel ist die Identifizierung von Proteinmarkern für Prostata-, Ovarien- und Blasenkrebs sowie die Alzheimer-Demenz. Die Firma Ciphergen Biosystems Inc. bietet mit ihrer ProteinChip®-Technologie das erste kommerzielle System für die krankheitsbezogene Proteinanalyse an (24).

Lab-on-A-Chip: Alles in Einem

Die Technik erlaubt die gleichzeitige Analyse von biologischem Material, beispielsweise Serum oder Zellextrakten, auf winzigen Trägern, in die feinste Reaktionskammern und Transportkanälchen von weniger als 10 µm Durchmesser eingeätzt sind. Das erste käufliche Gerät, der 2100 Bioanalyzer, wird von der Firma Agilent Technologies angeboten. Das Probenvolumen beträgt wenige Nanoliter. Die Proben werden in den Mikrokanälen des Glaschips durch elektrische Kräfte bewegt, portioniert, elektrophoretisch getrennt und analysiert. Die Analyse einer Probe dauert 90 Sekunden, zwölf unterschiedliche Proben werden in weniger als 30 Minuten analysiert. Das Detektionslimit liegt für DNA und RNA bei 5 ng/ml, der Nachweis erfolgt mittels Fluoreszenz-Detektion mit Laseroptik. Der Chip zeigt folgende Leistungsmerkmale (21, 22):

  • Auftrennung von doppelsträngiger DNA im Längenbereich zwischen 25 und 7500 Basenpaaren (bp); dies dient hauptsächlich der Längenbestimmung von Restriktionsfragmenten bei der Mutationsanalyse;
  • Auftrennung und Quantifizierung von PCR-Produkten, unter anderem zur Bestimmung von SNP;
  • Auftrennung von mRNA mit einer Länge zwischen 200 und 6000 Nukleotiden;
  • Auftrennung von Proteinen mit einem Molekulargewicht zwischen 14 und 200 kDa.

Chancen und Missbrauchsgefahr

Die Chip-Technologien werden nicht nur die Grundlagenforschung, sondern auch unser Leben weitreichend verändern. Sei es im täglichen Leben bei der Analyse von Nahrungsmitteln und Bodenproben oder in der Medizin bei der präzisen, umfassenden, schnellen und individuell maßgeschneiderten Diagnostik und Therapie. Ebenso ist eine genauere Abschätzung des persönlichen Krankheitsrisikos möglich, soweit Gene alleine dafür herangezogen werden können. Für den alltäglichen Routinebetrieb müssen die Geräte und die Chips jedoch noch billiger und robuster werden. Die ersten auf dem Chip-Konzept basierenden Analyseverfahren haben sich erfolgreich in der Praxis bewährt, besonders im Laborbereich.

Dennoch bestehen auch erhebliche Bedenken. Die Chip-Technologien beinhalten das Potenzial zur Schaffung des "gläsernen Menschen", der stets einen detaillierten molekularbiologischen Personalausweis im Kreditkartenformat bei sich trägt. Die Daten lassen sich im medizinischen Bereich zum Wohl, bei Missbrauch jedoch zum Nachteil des Betroffenen heranziehen.

Einen unbestreitbaren Durchbruch erfährt die DNA-Analytik in der Forensik, in der Massenuntersuchungen benötigt werden und Chip-Technologien ideal anwendbar sind. Fast täglich berichtet die Tagespresse über spektakuläre Erfolge der DNA-Bestimmung: Die Unschuld von "Tätern", die über viele Jahre zu Unrecht inhaftiert wurden, wurde on DNA-Analysen zweifelsfrei belegt. In anderen Fällen konnten Verbrecher fast zwanzig Jahre nach der Tat anhand des genetischen Fingerabdrucks identifiziert und überführt werden.

 

Literatur

  1. Hänel, F., Saluz, H. P., DNA-Chips - ein kurzer Überblick. BIOforum 22, Nr. 9 (1999) 504-507.
  2. Cerina, I., Biochips: From Science to Business. Transript 6, Nr. 3 (2000) 30-32.
  3. Ermantraut, E., Herstellung von biomolekularen Arrays - eine technologische Herausforderung. Medgen 11 (1999) 4-12.
  4. N. N., Neues maskenloses Verfahren für die DNA-Chip-Herstellung. Transcript 5, Nr. 10-11 (1999) 49.
  5. GeneScan AG, Weltweit erste Massenproduktionsanlage für Biochips. Triplett 3, Nr. 1 (2001) 16.
  6. Hoheisel, J. D., Vingron, M., DNS-Chip-Technologie. Biospektrum 4, Nr. 6 (1998) 17-20.
  7. Fodor, S. P. A., et al., Light-directed specially addressable parallel chemical synthesis. Science 251 (1991) 767-773.
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  9. N. N., DNA-Chips weiter auf dem Vormarsch. BioTec 12, Nr. 1 (2000) 14-15.
  10. Gaisser, S., Biochips - Trends und Perspektiven. Bio World 2 (1999) 48-49.
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  12. Troesch, A., et al., Mycobacterium species identification and TB rifampicin resistance testing with high density DNA probe arrays. J. Clin. Microbiol. (1998).
  13. Wadzack, J., Die Arbeit beginnt erst - Das Humangenomprojekt nach Vorlage der Arbeitsversion des menschlichen Genoms. Bioforum 23, Nr. 9 (2000) 550 -551.
  14. N. N., Genunterschiede verfügbar gemacht. Bioforum 24, Nr. 1-2 (2001) 9.
  15. N. N., Durchbruch in der DNA-Oligo-Arraytechnologie. Bioforum 24, Nr. 1-2 (2001) 10.
  16. Ehrentreich-Förster, E., et al., Probleme und Lösungen. Bioforum 23, Nr. 9 (2000) 560.
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  18. Shi, M., Applying SNP genotyping in drug development and clinical trials. Vortrag bei Pharmacogenomics Europe, 23.-24. Mai 2001, München.
  19. Houston, A., Pharmacogenomics in early drug development: Characterizing SNPs and haplotypes in drug target genes. Vortrag bei Pharmacogenomics Europe, 23. -24. Mai 2001, München.
  20. Baron, D., Proteomics - Proteine steuern das Leben. Pharm. Zeitung 146, Nr. 1 (2001) 10-16.
  21. Frommer, G., et al., GIT Laborzeitschrift 44, Nr. 2 (2000) 136-139.
  22. Greiner, M., et al., BIOforum 23, Nr. 11 (2000) 751-754.
  23. Maurer, M. H., Biochips: Neue Wege der Proteomanalyse. Bioforum 23, Nr. 12 (2000) 838-839.
  24. Dimond, P., Biochip Technology. GEN Okt. 15 (1999) 10.
  25. GeneScan AG, Bioforum 23, Nr. 9 (2000) 554-555.

 

Der Autor

Diethard Baron hat sich nach dem Biologiestudium und der Promotion in Biochemie von 1974 bis 1976 an der Harvard University in Boston mit der biochemischen und immunologischen Charakterisierung von Antigenen des Epstein-Barr-Virus beschäftigt. Anschließend führte er bis 1983 an der Transplantationsklinik Tübingen transplantationsimmunologische Arbeiten aus. 1982 habilitierte er sich im Fach Immunologie und wurde 1989 zum außerplanmäßigen Professor an der Universität Tübingen ernannt. Bis 1994 war Professor Baron in den Zweigwerken Tutzing und Penzberg der Boehringer Mannheim GmbH unter anderem für die Herstellung therapeutischer und diagnostischer monoklonaler Antikörper sowie rekombinanter therapeutischer Proteine zuständig. Seit Herbst 1994 ist Baron an der Fachhochschule Weihenstephan tätig. Für die PZ hat er bereits etliche spannende Titelbeiträge zu aktuellen Themen aus der Gentechnologie und Immunologie verfasst.

 

Anschrift des Verfassers:
Professor Dr. Diethard Baron
Fachhochschule Weihenstephan
Fachbereich Biotechnologie
85350 Freising
E-Mail: diethard.baron@fh-weihenstephan.de

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