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Arzneibuchnachweise optimieren

19.07.2004  00:00 Uhr

Arzneibuchnachweise optimieren

von Martin Goppel, Tobias Brem, Roland Hermann, Markus Reichold und Gerhard Franz, Regensburg

In Zusammenarbeit mit dem Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte (BfArM) wurden an einer Reihe von Drogen und Naturstoffen chromatographische Untersuchungen durchgeführt. Ziel war es, die High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC) einzuführen, beziehungsweise die Dünnschichtchromatographie (DC) zu ersetzen.

Die DC bietet wegen ihres geringen apparativen Aufwands und guten Reproduzierbarkeit in vielen Gebieten der pharmazeutischen Analytik und Qualitätskontrolle Vorteile gegenüber aufwendigen instrumentellen Methoden. Vor allem im Bereich der Arzneipflanzenanalytik stellt sie eine universell anwendbare Methode dar, die neben Identitäts- und Reinheitsnachweisen auch industrielle Inprozesskontrollen und Qualitätsnachweise zulässt (3). Die HPTLC wiederum stellt eine weitere Verbesserung der klassischen DC hinsichtlich Trennvermögen, Zeitbedarf und Materialverbrauch dar. Dennoch sind im Arzneibuch bisher nur HPTLC-Methoden explizit für die Identifizierung fetter Öle zugelassen (4).

Generell bestehen zwischen konventioneller DC und HPTLC hinsichtlich des Materials Unterschiede. Die stationäre Phase der HPTLC-Platten liegt auf einem Glasträger und ist mit Schichtdicken von 0,1 bis 0,2 mm wesentlich dünner aufgetragen als bei konventionellen analytischen DC-Platten (0,2 bis 0,25 mm) (5). Als Trägermaterial dient bei der klassischen DC meist Aluminium, seltener Glas. Daneben unterscheiden sich DC und HPTLC hinsichtlich Korngrößenverteilung und mittlerer Korngröße. Bei HPTLC-Platten kommen mittlere Korngrößen um die 6 µm (versus 15 µm bei DC) bei gleichzeitig sehr einheitlicher Korngrößenverteilung vor. Dies führt zu einer Verbesserung der Trennleistung für die HPTLC bei gleichzeitig geringerer Trennstrecke (1, 5, 6). Die nachweisbaren Banden zeigen eine verbesserte Auflösung neben geringerer Bandenverbreiterung (1).

Übertragbarkeit überprüfen

Auf Grund dieser Unterschiede müssen einige Analysenparameter auf ihre Übertragbarkeit hin überprüft werden. Bei der HPTLC spielt zunächst die Auftragemethode eine große Rolle. Der direkte Vergleich von manueller, unterstützt manueller und automatischer Auftragung zeigte, dass trotz kleiner Probenvolumina auch bei manueller Auftragung gut reproduzierbare Ergebnisse erreicht werden können. Der Vorteil der Führungshilfe zur Auftragung oder eines Halbautomaten besteht in der schnelleren, gleichmäßigeren und besser reproduzierbaren Applikation. Es konnte aber durchaus gezeigt werden, dass eine rein manuelle Auftragung, wie sie in der Regel im Apothekenlabor praktiziert wird, ebenfalls, wenn auch langsamer, zu einem sehr guten Ergebnis führt. Ein Hilfssystem ist dann zu empfehlen, wenn regelmäßig Chromatogramme gemacht werden, da die Zeitersparnis erheblich ist.

Weiterhin wurden Variationen der Parameter Bandenbreite, Trennstrecke und Auftragevolumen untersucht. Als günstig erwies sich für die HPTLC ein Auftragevolumen von etwa 10 bis 30 Prozent des für die DC vorgeschriebenen Volumens. Übersichtliche Fingerprints erhält man, wenn man mit einer Bandenbreite von 10 mm auf der HPTLC-Platte arbeitet. In den meisten Fällen, in denen im Arzneibuch eine punktförmige Auftragung vorgesehen ist, führt eine bandenförmige Applikation zu einem einheitlicheren Chromatogramm. In diesem Fall wäre es wünschenswert, wenn im Arzneibuch nicht nur Volumenangaben sondern ebenfalls streckenbezogene Angaben des Auftragevolumens in [µl/cm] gemacht würden.

Die Entwicklung des HPTLC erfolgt idealerweise über eine Trennstrecke von 6 cm. Ist für einen Drogenextrakt in der jeweiligen Monographie eine Entwicklung über 15 cm auf einer DC-Platte vorgeschrieben, bietet sich auf der HPTLC-Platte eine Laufstrecke von 7 oder 7,5 cm an. Eine Zusammenfassung der wichtigsten Unterschiede DC/HPTLC bezüglich der methodischer Parameter ist in der Tabelle dargestellt.

 

Tabelle: Wichtige Unterschiede zwischen konventioneller analytischer DC und HPTLC

 DCHPTLC Schichtdicken 0,2 bis 0,25 mm 0,1 bis 0,2 mm Plattengröße 20 x 20 cm 10 x 10 cm Mittlere Korngröße 15 µm 6 µm Korngrößenverteilung breit gleichmäßig Fließmittelbedarf (halbe Doppeltrogkammer) 40 ml 12,5 ml Probenvolumen 5 bis 30 µl 1 bis 7 µl Trennstrecke 10 bis 15 cm 5 bis 7cm Entwicklungszeiten 20 bis 120 min 10 bis 25 min

 

Auflösung teilweise sogar besser

Exemplarisch wurden für verschiedene Inhaltsstoffgruppen DC- und HPTLC-Fingerprintanalysen von Arzneibuchdrogen dargestellt und an Hand derer die Übertragbarkeit der Methodik dokumentiert. Die Durchführung erfolgte nach den Vorschriften des aktuellen Europäischen Arzneibuchs. Die als Beispiel abgebildete Dokumentation der Trennung von Johanniskraut (8) und Eukalyptusblättern (9) macht deutlich, dass eine alternative Anwendung der HPTLC sehr gut möglich ist. Wie bereits in ähnlichen Untersuchungen gezeigt werden konnte, ist das Resultat der HPTLC-Entwicklung vergleichbar, aber nicht immer identisch (6, 10). Das Bandenmuster des HPTLC-Chromatogramms entspricht jedoch in allen Fällen den DC-Vorgaben hinsichtlich Anzahl, Farbe, Intensität und relativer Position der vorkommenden Banden; lediglich die Rf-Werte sind leicht unterschiedlich. Ein Identitätsnachweis nach den gegebenen Vorschriften des Arzneibuchs ist daher problemlos möglich.

Bei der HPTLC beträgt die Entwicklungszeit oft nur die Hälfte oder gar nur ein Drittel der Zeit, die man für die Entwicklung der DC benötigen würde. Obwohl die chromatographische Trennung wesentlich schneller abläuft, kann keineswegs ein Defizit in der Auflösung festgestellt werden. Die Auflösung der HPTLC ist in vielen Fällen sogar besser als die der TLC. Eine besonders gute Auflösung erhält man im Rf-Bereich zwischen 0,3 bis 0,4 (7). Beim Vergleich der Auflösung ist allerdings die Tatsache zu berücksichtigen, dass die Rf-Werte bei der HPTLC in vielen Fällen höher liegen als bei der DC. Bei einer Verschiebung relevanter Banden bei der HPTLC über 0,5 hinaus kann es daher auch zu geringfügig schlechterer Auflösung führen. Dieser Effekt trifft aber nur in wenigen Fällen für die gewählten Referenzsubstanzen zu.

Daneben ist der Fließmittelbedarf mit 13 ml pro halbe Kammer deutlich geringer. Ein weiterer, durchaus wichtiger Kostenfaktor sind die nach Arzneibuch vorgesehenen, zuweilen relativ teuren Referenzsubstanzen. Dies kann durch die Einführung der HPTLC ebenfalls reduziert werden, da die für ein Chromatogramm nötige Referenz-Substanzmenge um bis zu 75 Prozent gesenkt werden kann. Hinsichtlich der unterschiedlichen Platten ist kein wesentlicher Preisvorteil vorhanden, da kommerzielle 20 x 20 cm Aluminium-DC-Platten in etwa so teuer sind wie 10 x 10 cm HPTLC-Platten.

Als geringfügiger Nachteil stellt sich bei der HPTLC die verminderte Belastbarkeit der Platten dar, da sich die Kieselgelschicht an den Rändern relativ leicht vom Glas löst. Besonders empfindlich sind RP (reversed phase)-Platten. Diese Tatsache muss man besonders beim Auftragen der Proben berücksichtigen. In diesem Zusammenhang ist die manuelle Auftragung mit einer Glaskapillare von Nachteil, da die Oberfläche bei der Berührung leichter beschädigt werden kann, was sich nachteilig auf die Qualität der Trennung auswirkt.

Farbiges Beispiel wäre sinnvoll

Jede Pflanzenmonographie des Europäischen Arzneibuches enthält unter Identifikation C eine exakte drogenbezogene Anweisung für die Durchführung der Chromatographie. Dort finden sich Angaben über das zu verwendende Sorbens, die Herstellung der Probe- und Referenzlösungen, die zu verwendende mobile Phase, alle notwendigen Angaben zur Entwicklung und Detektion sowie ein Schema zur Auswertung des Fingerprints der Platten. Zurzeit gibt es zwei Varianten dieser „Auswertungshilfen“. Zum einen die verbale Beschreibung des Chromatogramms und zum anderen die übersichtliche Darstellung in einem Kasten, wobei dieser eine schnelle und mehr oder weniger fehlerfreie Auswertung der Trennergebnisse und den Vergleich mit den Vorgaben des Arzneibuches ermöglicht. Eine weitere Verbesserung der Auswertung könnte erreicht werden, wenn zusätzlich eine authentische farbige Abbildung eines Musterbeispiels in der Monographie oder einem gesonderten Bildband angeboten würde, um dem Nutzer damit einen deutlichen Vergleich für Farbigkeit und Positionierung der Banden zu dokumentieren.

 

Fazit Die Untersuchung eines Großteils der im aktuellen Arzneibuch monographierten Drogen durch DC und HPTLC führt zu vergleichbaren Ergebnissen (11). Die HPTLC stellt somit eine breit einsetzbare, geld- und zeitsparende Alternative zur bisherigen DC dar. Die Analysenparameter Auftragevolumen, Fließmittelvolumen und Trennstrecke müssen für die HPTLC allerdings entsprechend reduziert werden. Es wäre in diesem Zusammenhang wünschenswert, dass die HPTLC als Alternative zur DC in die allgemeine Monographie zur DC (2) aufgenommen wird und zur Verbesserung der Auswertung die Möglichkeit zum Vergleich mit farbigen Abbildungen im Arzneibuch Einzug halten würde. Die vorgeschriebene Drogenidentifizierung könnte damit erheblich erleichtert und beschleunigt werden.

 

Literatur

  1. Reich, E., Blatter, A., Meier, B,: TLC fort he Analysis of Herbal Drugs, Pharmeuropa Vol. 15, No. 3, 424 – 430.
  2. Monographie 2.2.27: Dünnschichtchromatographie, Ph. Eur. 2002.
  3. Adam, K. P., Becker, H.: Analytik biogener Arzneistoffe, Pha rmazeutische Biologie Band 4, Wiss. Verlagsges. Stuttgart, (2000) 79 - 99.
  4. Monographie 2.3.2: Identifizierung fetter Öle durch Dünnschichtchromatographie, Ph. Eur. 2002.
  5. Rücker, G., Neugebauer, M., Willems, G.G.: Instrumentelle pharmazeutische Analytik. Wiss. Verlagsges. Stuttgart, (2001) 468 – 485.
  6. Hahn-Deinstrop, E.: Dünnschichtchromatographie, Praktische Durchführung und Fehlervermeidung, Verlag Wiley-VCH, (1998) 29.
  7. Reich, E., Blatter, A., Meier, B,: TLC für die Analyse von Phytopharmaka, GIT Spezial Separation , (2003) 24 - 25.
  8. Monographie 1438 : Johanniskraut, Ph. Eur. 2002
  9. Monographie 1320: Eucalyptusblätter, Ph. Eur. 2002
  10. Pachaly, P.: DC-Atlas, Dünschichtchromatographie in der Apotheke, Wiss. Verlagsges. Stuttgart (2002) 46 - 47.
  11. Interner Bericht BfArm, auf Anforderung erhältlich bei den Autoren.

 

Dank: Für die Bereitstellung der Geräte zur Auftragung, zum Besprühen und zur Dokumentation der Ergebnisse gilt unser Dank den Firmen Camag, Muttenz (Schweiz) und Desaga, Wiesloch (Deutschland).

 

Anschrift für die Verfasser:
Professor Dr. Gerhard Franz
Lehrstuhl für pharmazeutische Biologie, Universität Regensburg
Universitätsstraße 31
93043 Regensburg
gerhard.franz@chemie.uni-regensburg.de
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