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Lichtblitze enthüllen Resistenzen

23.08.2004
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Genomforschung

Lichtblitze enthüllen Resistenzen

von Imme Schröder, Hamburg

Am Institut für Pharmazie der Universität Hamburg wird das Erbgut von Bakterienstämmen mit neuester Technik entschlüsselt. Das Pyro-Sequencing ermöglicht eine frühzeitige Erkennung von Antibiotikaresistenzen und könnte so zukünftig die Suche nach einer lebensrettenden Medikation vereinfachen und beschleunigen.

Immer schneller schreiten die Entwicklungen der Genomforschung voran – für die Forschung sind die Ergebnisse Grundlage für stetige Entwicklung neuer Wirkstoffe und Mechanismen. Dabei werden die Verfahren zu Entschlüsselung des Erbguts immer spezifischer an die jeweilige Problemstellung angepasst.

Am Institut für Pharmazie der Universität Hamburg forscht der Arbeitskreis um Institutsleiter Professor Dr. Peter Heisig auf dem Gebiet der Antibiotikaresistenz von Bakterienstämmen. Seit Frühjahr 2004 ergänzt der 26-jährige Apotheker Björn Timmerbeil das Team, der nach seinem Pharmazie-Studium in Freiburg ein halbes Jahr am Center of Pharmacogenomics der University of Florida (Gainesville, USA) unter der Leitung von Professor Dr. Julie Johnson den zweiten Teil seiner praktischen Ausbildung absolvierte und erste Erfahrungen mit der Methode des Pyro-Sequencing sammeln konnte (siehe Kasten).

 

Prinzip des Pyro-Sequencings In einer vorgeschaltenen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird, unter Einsatz eines Biotin-markierten Oligonukleotids als Primer, zunächst ein doppelsträngiges DNA-Fragment erzeugt. Nach alkalischer Denaturierung der DNA-Doppelstränge wird mit Hilfe von Streptavidin der mit Biotin markierte DNA-Einzelstrang isoliert. Nach Zugabe eines Sequenzierprimers und kurzem Erhitzen wird dieser Strang als Vorlage (Template) für die eigentliche Sequenzreaktion verwendet. Schrittweise werden die vier Desoxynukleotidtriphosphate als Bausteine für den komplementären Gegenstrang automatisch zu der so vorbereiteten Probe zugesetzt. Nur bei dem Schritt, in dem das komplementäre Nukelotid eingebaut wird, wird am Ende der Reaktion Pyrophosphat (PPi) freigesetzt. Dieses wird direkt durch die ATP-Sulfurylase quantitativ zu ATP umgesetzt. Dieses ATP dient wiederum dem Enzym Luciferase als Energiequelle und ermöglicht so die Umsetzung von Luciferin zu Oxyluciferin. Dabei wird proportional zur gebildeten Menge ATP sichtbares Licht freigesetzt, das im Pyro-Sequencer mit einer Photodiode oder einer Kamera registriert und im Pyrogramm als ein dem Lichtblitz proportionaler Peak sichtbar gemacht wird. Nicht verbrauchte Desoxynukleotide werden mit Hilfe des Enzyms Apyrase abgebaut.

 

Mutationen aufdecken

Als genetische Ursache für eine Antibiotikaresistenz kommen neben der Aufnahme neuer Resistenzgene vor allem puntktuelle Veränderungen (Punktmutationen) am vorhandenen Erbgut vor. Zur Detektion solcher Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) in größerem Umfang wurden bislang relativ unspezifische Techniken, wie die Bestimmung über einen Restriktions-Fragmentlängen-Polymorphismus (RFLP) oder kosten- und zeitaufwendige Verfahren wie die DNA-Sequenzierung eingesetzt. Mit der Methode des Pyro-Sequencing lassen sich heute schneller und kostengünstiger – es werden nur etwa zehn Minuten für die Auswertung von 96 Proben gerechnet – bekannte SNPs genau bestimmen. Das Ergebnis wird nach einer Computeranalyse in Form eines so genannten Pyrogramms ausgegeben, das direkt die Nukleotidfolge einschließlich der gesuchten Mutation darstellt. Die gesamte Reaktion, von der Polymerisation bis zur Detektion des Lichtsignals, dauert nur drei bis vier Sekunden. „Nachteilig kann die Beschränkung der Methode auf kürzere Genabschnitte bis circa 100 Basenpaare sein“, erläutert Timmerbeil die Grenzen des Verfahrens. Auch die Probenaufbereitung erfordert keine langen Prozesszeiten, eine Elektrophorese entfällt beim Pyro-Sequencing.

 

Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) Die Polymerase Chain Reaction (PCR) ist ein Verfahren zur Amplifizierung (Vervielfältigung) kleinerer Mengen an DNA. Schon Fragmente einzelner DNA-Abschnitte können mit Hilfe der Methode in analytisch verwertbare Proben vermehrt werden. Die PCR ermöglicht so nicht nur die Erstellung genetischer Fingerabdrücke, sondern spielt auch in der alltäglichen Laborarbeit ein wichtige Rolle, zum Beispiel bei der Bestimmung von Bakterien-DNA.

Die doppelsträngige DNA wird zu Beginn des Prozesses durch Erhitzen in Einzelstränge getrennt (Denaturierung). Am Anfang und am Ende des spezifischen Abschnitts werden Starthilfen, die so genannten Primer zugesetzt, die sich an passende Basenabschnitte der DNA anlagern (Annealing). Zu dem dazwischen liegenden DNA-Abschnitt wird mit Hilfe des Enzyms Polymerase der jeweils komplementäre DNA-Strang synthetisiert (Extension). Der so gebildete Doppelstrang wird durch Erhöhung der Temperatur erneut getrennt. Damit sind die Bindungsstellen für die Primer erneut frei und der Vorgang kann nach dem Absinken der Temperatur von neuem starten. Nun liegt die doppelte Anzahl DNA-Abschnitte vor, durch häufiges Wiederholen dieses Vorgangs wird eine exponentielle Amplifizierung erreicht. Der Vorgang läuft in automatisch arbeitenden Geräten, den Thermocyclern, ab.

 

Etwa 90.000 Euro kostet ein Pyro-Sequencing-Gerät (Modell PSQ MA96), die Anwendungsmöglichkeiten sind vielfältig: „In Florida wurden mit Hilfe des Verfahrens die Genotypen im Gen für den Rezeptor NPR-A von Probanden einer pharmakogenetischen Studie bestimmt. Ein Polymorphismus innerhalb des Gens könnte mit einem erhöhten Hypertonie-Risiko, zum Beispiel auf Grund einer Änderung der Rezeptorstruktur, assoziiert sein“ erklärte Timmerbeil.

Frühes Erkennen kann Leben retten

In Hamburg nutzen die Forscher das Verfahren zum schnellen Nachweis bestimmter Resistenzeigenschaften von Bakterienstämmen. Neben der Detektion von SNPs lassen sich auch kleinere Insertionen oder Deletionen von Nukleotiden nachweisen. Timmerbeil forscht im Rahmen seiner Dissertation an einem schnellen und sicheren Nachweissystem für Betalactamasen mit einem erweiterten Substratspektrum, die ein großes Problem in der antibakteriellen Therapie darstellen. Es handelt sich dabei um Resistenzmechanismen, die häufig auch neue Penicilline und Cephalosporine mit breitem Spektrum betreffen. „Die frühzeitige Erkennung von Resistenzen ist besonders für schwer kranke Patienten lebensrettend, um rechtzeitig eine geeignete therapeutische Option nutzen zu können“, sagte der Apotheker. Top

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