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Pionier der Primärstruktur

30.05.2005  00:00 Uhr
Insulin

Pionier der Primärstruktur

von Peter Nuhn, Halle

Vor 50 Jahren erschien im Biochemical Journal eine Arbeit von Frederick Sanger, E. O. P. Thompson und R. Kitai mit dem eher unspektakulären Titel »The Amide Groups of Insulin«, in der erstmals die Primärstruktur des Insulins bekannt gemacht wurde. Mit diesem Artikel war die Aminosäuresequenz des ersten »Proteins« aufgeklärt worden.

Die wissenschaftliche Leistung wurde als so bedeutend angesehen, dass der 1918 geborene Frederick Sanger bereits drei Jahre später als alleiniger Laureat den Nobelpreis für Chemie »for his work on the structure of proteins, especially that of insulin« zuerkannt bekam. Nur beiläufig soll erwähnt werden, dass Sanger 1980 zusammen mit Paul Berg und Walter Gilbert nochmals einen Nobelpreis für Chemie für die Untersuchungen zur Sequenzanalyse der Nucleinsäuren erhielt, die neben der Aufklärung der Doppelhelixstruktur der DNA durch J. D. Watson und F. H. C. Crick die Grundlage für die Entwicklung der Molekularbiologie bildeten. Sanger gehört damit zu den wenigen Wissenschaftlern, die einen Nobelpreis zweimal bekamen und ist sogar der einzige, der zwei Nobelpreise für das gleiche Fachgebiet bekam. Zweifache Nobelpreisträger sind noch Marie S. Curie (1867-1934), die 1903 den Nobelpreis für Physik und 1911 den Nobelpreis für Chemie erhielt, sowie Linus C. Pauling (1954 Nobelpreis für Chemie und 1962 Nobel-Friedenspreis).

Vorreiter der Proteinchemie

Das Aufsehen, das der Artikel von Sanger und seinen Mitarbeitern erweckte, hängt auch mit der Bedeutung des von ihm untersuchten Objektes - des Insulins - zusammen. Insulin - der Name soll an den Bildungsort, die b-Zellen der Langerhans-Inseln des Pankreas erinnern - stand auf Grund seiner Wirkung als blutzuckersenkendes Hormon, durch dessen Ausfall es zur Ausbildung eines Diabetes kommt, schon frühzeitig im Mittelpunkt der Hormonforschung und Proteinchemie. Insulin verdiente viele Eintragungen in das Guinness-Buch der Rekorde, da es eine Vorreiterrolle in der Proteinchemie einnimmt. Dabei ist Insulin eigentlich auf Grund seiner relativ niedrigen Molmasse von etwa 12.000 (als Dimer) gar kein Protein, sondern ein Polypeptid, das in der monomeren Form insgesamt 51 Aminosäuren enthält. Beim Insulin sind zwei unterschiedlich lange Polypeptidketten (A-Kette: 21; B-Kette: 30 Aminosäuren) über zwei Disulfidbrücken miteinander verbunden.

Insulin wurde 1921 erstmals durch Frederick G. Banting und Charles H. Best aus Pankreasgewebe isoliert. Als erster Patient wurde der damals 12-jährige, an Diabetes erkrankte Leonard Thompson im Januar 1922 am Toronto General Hospital durch Walter R. Campbell mit Insulin behandelt (1). Benting und dessen Chef John J. R. Macleod erhielten 1923 den Nobelpreis für Medizin, den sie freiwillig mit Best und James B. Collip teilten.

Insulin industriell nicht nutzbar

1963 bis 1965 gelang in der Arbeitsgruppe von Helmut Zahn am Deutschen Wollforschungsinstitut in Aachen und unabhängig davon auch durch die Gruppe um Panayotis G. Katsoyannis in den USA und zwei chinesische Gruppen die erste chemische Totalsynthese des Insulins, die jedoch auf Grund der über 200 Synthesestufen industriell nicht nutzbar war. 1969 konnte Dorothy Crowfoot-Hodgkin, die 1964 den Nobelpreis für Chemie für die Strukturaufklärung des Vitamin B12 erhielt, die räumliche Struktur des Schweineinsulins durch Röntgenstrukturanalyse in einer Auflösung von 2.8Å aufklären (2), nachdem bereits 1934 erste Röntgenbeugungsbilder von Insulin erhalten werden konnten (J. D. Bernal). 1982 gelang mit dem Insulin die erste gentechnische Proteingewinnung. Seit 1966 sind auch strukturell geringfügig veränderte und gentechnisch hergestellte Insuline (Analoginsuline) mit veränderten pharmakokinetischen Eigenschaften auf dem Markt. Sanger begann 1943 nach seiner Promotion in Cambridge mit Arbeiten auf dem Gebiet der Proteinchemie. Nach den Pionierarbeiten von Emil Fischer war klar, dass die Proteine aus Aminosäuren aufgebaut sind, die über Amidbindungen miteinander verbunden sind. 20 verschiedene Aminosäuren waren als Bestandteile von Proteinen bekannt. Unklar war aber, wie die Aminosäuren in den Proteinen angeordnet sind. Die Fischer-Schüler Bergmann und Niemann waren zum Beispiel der Meinung, dass die Aminosäuren in Art von Blockpolymeren angeordnet sind, um eine moderne Terminologie zu gebrauchen. Auf Grund der Schwierigkeiten, Proteine kristallin zu erhalten - für viele Synthesechemiker war nur das interessant, was auch kristallisierte -, war man sogar der Meinung, dass Proteine gar keine chemischen Individuen seien, sondern Gemische.

Von wesentlicher Bedeutung für die Fortschritte auf dem Gebiet der Proteinchemie war die Entwicklung chromatographischer Methoden, ohne die auch die Arbeiten von Sanger nicht möglich gewesen wären. Die Adsorptionschromatographie wurde zwar schon 1906 von dem russischen Botaniker M. S. Tswett zur Auftrennung von Pflanzenfarbstoffen entwickelt, größere Bedeutung erhielt sie aber erst durch die 1941 bis 1943 durch Martin, Gordon und Synge geschaffene Verteilungschromatographie, durch die freie und derivatisierte Aminosäuren und Peptide getrennt werden konnten.

Die Entscheidung von Sanger, Insulin als Objekt seiner Untersuchungen auszuwählen, kam zu Stande, weil Insulin relativ leicht isoliert und bereits 1926 durch John Abel von der John Hopkins University kristallin erhalten werden konnte. Seit 1936 wurde bei Hoechst in Deutschland sogar kristallisiertes Insulin industriell produziert (3). Die ersten Proteine, die kristallisiert werden konnten, waren das Enzym Urease und die in größeren Mengen in der Schwertbohne enthaltenen Lectine Concanavalin A und B. James Batcheller Sumner erhielt dafür 1945 den Nobelpreis für Chemie.

Die von Sanger entwickelte Methode zur Bestimmung der Reihenfolge der Aminosäuren (4) in einem Peptid beruht darauf, dass bei den durch Hydrolyse erhaltenen Peptidfragmenten die endständige Aminosäure mit 2,4-Dinitrofluorbenzol umgesetzt wurde und die am N-Terminus derivatisierten DNP-Peptide anschließend hydrolysiert wurden. Die durch Hydrolyse erhaltenen Aminosäuren wurden chromatographisch aufgetrennt und quantitativ bestimmt. Die gelben N-terminalen DNP-Aminosäuren konnten chromatographisch identifiziert wurden. Damit waren zunächst nur die N-terminale Aminosäure und die noch in der Kette enthaltenen Aminosäuren bekannt. Die Reihenfolge ergab sich durch wiederholte DNP-Markierung kürzerer, durch Hydrolyse erhaltener Peptidfragmente. Ein sehr mühsames Puzzle-Spiel, das nach zwölf Jahren zur kompletten Sequenzanalyse des Insulins führte. Dabei hatte Sanger noch Glück bei der Wahl seines Objektes, da Insulin weder Tryptophan noch Methionin enthält, die durch säurekatalysierte Hydrolyse zerstört werden. Auf der anderen Seite enthält Insulin allerdings drei Disulfidbrücken, davon zwei interchenare, deren Verknüpfung bestimmt werden musste.

1945 ermittelte Sanger, dass Insulin vier freie N-Termini (zwei Glycin und zwei Phenylalanin), also vier Polypeptidketten enthielt (5), was für eine dimere Struktur sprach. 1951 wurde die Sequenz der B-Kette (phenylalanyl chain) (6), 1953 die der A-Kette (glycyl chain) (7) veröffentlicht. Merkwürdigerweise findet sich in der Zeitschrift »Angewandte Chemie« kein Hinweis auf die Nobelpreisvergabe, auch der Nobel-Vortrag (8) ist im Unterschied zu anderen Laureaten nicht abgedruckt.

Trotz der enormen Bedeutung, die die Entwicklung der Sequenzanalyse für Proteine mittels der DNP-Markierung hatte, ist die von Sanger entwickelte Methode heute im Wesentlichen nur noch von historischem Interesse, da die Primärstruktur der Proteine inzwischen viel schneller und kostengünstiger durch Sequenzierung der die Proteine kodierenden Gene erhalten werden kann - eine Entwicklung, die vor 50 Jahren noch niemand für möglich gehalten hätte und an der Sanger durch seine Nucleinsäure-Sequenzierungsmethode entscheidenden Anteil hat.

 

Literatur

  1. Banting, F. G., Best, C.H., Collip, J. B., Campbell, W. R., Fletcher, A. A.: Pancreatic extracts in the treatment of diabetes mellitus. Can.Med.Assoc.J. 12 (1922) 141.
  2. Adams, M. J. et al. : Structure of Rhomohedral 2 Zinc Insulin Crystals. Nature 224 (1969, 491- 494 .
  3. Dilg, P.: Zur Frühgeschichte der industriellen Insulin-Herstellung in Deutschland. Pharmazie in unserer Zeit 30 (2001) 10-15.
  4. Sanger, F.: The arrangement of amino acids in proteins. Adv.Protein Chem. 7 (1952) 1-66.
  5. Sanger, F.: The free amino groups of insulin. Biochem. J. 39 (1945) 507-515.
  6. Sanger, F., Tuppy, H.: The amino-acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin. 1. The identification of lower peptides from partial hydrolysates. Biochem. J. 49 (1951) 463-481. 2. The investigation of peptides from enzymic hydrolysates. Biochem. .J. 49 (1951) 481-490
  7. Sanger, F., Thompson, E.O.P.: The amino-acid sequence in the glycyl chain of insulin. 1. The investigation of lower peptides from partial hydrolysates. Biochem. .J. 53 (1953) 353-366. 2. The identification of lower peptides from partial hydrolysates. Biochem. .J. 53 (1953) 366-374.
  8. Sanger, F.: Les Prix Nobel en 1958. P. A.Norstedt & Söner, Stockholm 1959. http:// nobelprize.org/chemistry/laureates/1958/sanger-lecture.
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