Pharmazeutische Zeitung online

PZ Titel

25.11.1996
Datenschutz bei der PZ

-
Titel

  Govi-Verlag

Die Patch-clamp-Technik und ähnliche Meßverfahren

  Ein koordinierter Informationsfluß durch Zellmembranen ist die Voraussetzung für jedes Leben. Dazu dienen transmembranale Ionenkanäle, durch die Ströme fließen. Mit Hilfe von elektrophysiologischen Meßmethoden kann man diese Prozesse in Echtzeit studieren. Eine besondere Rolle spielt die Patch-clamp-Technik, da sie eine hohe Auflösung von Ionenströmen durch einzelne Kanäle sowie vielfältige Kombinations- und Einsatzmöglichkeiten erlaubt. Ihre Entdecker, die Professoren Erwin Neher und Bert Sakmann, erhielten dafür 1991 den Nobelpreis für Medizin und Physiologie.

Obwohl seit Ende der vierziger Jahre der Stromfluß an Zellmembranen gemessen wurde, bereiteten direkte Einzelkanalmessungen der Ströme im Pikoampère-Bereich erhebliche Schwierigkeiten. Das Hintergrundrauschen des Präparates überdeckt das eigentliche Meßsignal. Neher und Sakmann versuchten in den siebziger Jahren, die Empfindlichkeit der Methode zu erhöhen. Sie isolierten kleine Membranflecken, indem sie fein ausgezogene Glaskapillaren mit Elektrolytlösung füllten und auf die Zelloberfläche aufsetzten. Ströme, die direkt unter der Pipettenöffnung flossen, sollten durch das schlecht leitende Glas von Strömen außerhalb der Pipette abgeschirmt werden. Der Durchbruch gelang jedoch erst, als Neher per Zufall feststellte, daß durch Ansaugen der Membran mit einer frischen Meßpipette der Abdichtwiderstand um mehrere Zehnerpotenzen in den Gigaohm-Bereich stieg. Durch den engen Abstand zwischen Pipette und Membranfleck von etwa 0,1 nm wird eine elektrische Abgrenzung und eine hohe mechanische Stabilität erzielt.

Ausgehend von dieser als Cell-attached bezeichneten Konfiguration sind weitere Meßkonfigurationen möglich. Bricht man mit einem kurzen Saug- oder Spannungspuls ein Loch in die Membran unter der Pipettenöffnung, kann man im Whole-cell-Modus messen. Dabei werden alle elektrogenen Ströme, die durch die Zellmembran fließen, gemessen. Dagegen lassen sich Einzelkanalmessungen in dem Cell-attached-Modus und an Membranflecken (Excised patches) ausführen. Je nach Versuchsbedingungen zeigt die Membraninnenseite nach außen in die Badlösung (Inside-out-patch) oder nach innen in die Pipette (Outside-out-patch). Perforated patches entstehen durch intrazelluläre Zugabe von Nystatin oder Amphotericin B, die die Zellmembran permeabel für kleine Moleküle (Molmasse unter 300) machen.

Leitfähigkeitsmessung

Mit der Patch-clamp-Technik werden alle nicht elektroneutralen, transmembranalen Ströme erfaßt. Hierunter fallen besonders solche, die durch Ionenkanäle fließen. Man unterteilt diese Poren in folgende Klassen:

o Spannungsabhängige Kanäle öffnen und schließen sich bei Veränderungen des Spannungsgradienten über der Zellmembran. Für Na+-, K+-, Ca2+- und Cl--Ströme wurden solche Kanalproteine in der Zellmembran nachgewiesen.

o Rezeptorgesteuerte Kanäle öffnen als Reaktion auf die Bindung extrazellulärer Agonisten an speziellen Stellen der Zelloberfläche. So führt N-Acetylcholin an dem n-ACh-Rezeptor zur Aktivierung eines Kationenstroms. Durch den Einstrom positiver Ladungsträger depolarisiert die Zelle und aktiviert spannungsabhängige Kanäle.

o Second-messenger-kontrollierte Ionenkanäle werden durch intrazelluläre Botenstoffe reguliert. Solche Transmitter sind zum Beispiel cyclische Nukleotide oder Ca2+.

o Volumensensitive Ionenkanäle aktivieren bei Osmolaritätsunterschieden zwischen Zellinnerem und extrazellulärem Milieu. Häufig handelt es sich dabei um Chloridströme.

o Speicherregulierte Kanäle öffnen bei Entleerung des intrazellulären Calcium-Speichers und führen zu einem Ca2+-Einstrom, dessen physiologische Bedeutung wahrscheinlich die Wiederauffüllung des Reservoirs ist.

Kapazitätsmessung

Neben der Messung von Strömen können mit der Patch-clamp-Technik auch Kapazitäten erfaßt werden. Nach physikalischen Gesetzen verhalten sich Kapazitäten proportional zu den Oberflächen eines Plattenkondensators. Dies gilt auch für biologische Membranen, so daß Oberflächenänderungen, zum Beispiel beim Verschmelzen von einzelnen Vesikeln mit der Zellmembran, aus gemessenen Kapazitätsänderungen berechnet werden können. Für biologische Membranen liegen die Kapazitäten im Bereich von 1 mikroFarad (µF)/cm2.

Amperometrie

Bei der Fusion sehr kleiner Vesikel, zum Beispiel von Katecholamin-speichernden Vesikeln der chromaffinen Zellen aus dem Nebennierenmark, entsteht nur ein geringer Kapazitätszuwachs, der an der Auflösungsgrenze der Meßmethode liegt. Daher koppelt man die Patch-clamp-Technik mit der Amperometrie, bei der eine Kohlenstoffelektrode zur polarographischen Detektion von freigesetzten redoxaktiven Substanzen dient. Aus den Meßergebnissen kann man berechnen, daß drei Millionen Moleküle Adrenalin oder Noradrenalin pro Exozytosebläschen aus den chromaffinen Zellen des Rindes freigesetzt werden.

Ausblick

Elektrophysiologische Meßmethoden werden bei vielfältigen Fragestellungen eingesetzt. So können Wirkmechanismen von Pharmaka identifiziert, gentechnisch veränderte Ionenkanäle vermessen und pathologische Kanalveränderungen, die beispielsweise der Mukoviszidose zugrundeliegen, aufgeklärt werden.

PZ-Titelbeitrag von Matthias Bödding, Göttingen        

© 1996 GOVI-Verlag
E-Mail:
redaktion@govi.de

Mehr von Avoxa