PROTEOMICS

Proteine steuern das Leben

von Diethard Baron, Penzberg

Leben verstehen - ein uralter Traum von Biologen und Medizinern, ja eigentlich jedes Menschen. Will man dieses Ziel erreichen, dann führt kein Weg an den Proteinen vorbei. In Analogie zum Genom, das die Gesamtheit aller Gene in einem Organismus umfasst, bezeichnet der Begriff "Proteom" die Gesamtheit aller Proteine, die zu einem bestimmten Zeitpunkt in einer Zelle oder einem Gewebetyp exprimiert werden. Die Analyse des Proteoms wird "Proteomics" genannt; sie ermöglicht Aussagen über Proteine und deren Funktionen. Proteomics wird die Aufgabe dieses Jahrhunderts sein.

Der Name "Proteom" wurde 1994 durch die beiden australischen Wissenschaftler Williams und Wilkins geprägt. Die erste Proteomic-Firma (Large Scale Biology Corporation) wurden 1984 in Rockville (Maryland, USA) gegründet.

Mehr als fünfzig Prozent der Trockensubstanz einer menschlichen oder tierischen Zelle bestehen aus Proteinen; der Rest sind Lipide, Kohlenhydrate und Nukleinsäuren. Im menschlichen Körper gibt es schätzungsweise 80 000 unterschiedliche Proteine, davon etwa 50 000 Enzyme. Proteine üben im Körper mannigfaltige Funktionen aus (Tabelle 1, am Ende dieser Seite). Schon der Ausfall eines Proteins kann zu schweren Krankheiten führen, zum Beispiel zur Phenylketonurie, Mucoviscidose, Hämophilie oder Duchenne-Muskeldystrophie. Proteine steuern als Enzyme unsere Lebensfunktionen und bestimmen äußere Merkmale wie Haar- oder Augenfarbe. Proteine bestimmen aber auch Krankheitsanfälligkeit, Krankheitsresistenz und individuelle Reaktionen auf Medikamente.

Das Genom des Menschen ist fast zu hundert Prozent entschlüsselt, die Abfolge von etwa 3,4 Milliarden Bausteinen (Basen) ist jetzt bis auf wenige Lücken bekannt (1). Dieser wissenschaftliche Durchbruch wurde Anfang 2000 von den Fachleuten weltweit begeistert gefeiert. Das bis dahin größte und teuerste Forschungsvorhaben der Menschheit war erfolgreich beendet worden. Insgesamt hatte das HGP-Projekt (Human Genome Project; HUGO) etwa zehn Jahre gedauert; etwa 7 Milliarden DM wurden investiert und 25 internationale Forschungszentren waren daran beteiligt. Letztendlich ist es für den Gesamterfolg unerheblich, ob ein multinationales Konsortium oder der Alleingang der Firma Celera Genomics unter der Führung von Craig Venter den Erfolg erzielten.

HUGO war erst der Anfang

Ohne die grandiose Leistung der Gen-Wissenschaftler schmälern zu wollen, so muss doch klar gesagt werden, dass man mit der Sequenzierung des menschlichen Genoms dem Ziel, Leben zu verstehen, nur unwesentlich näher gekommen ist. Denn jetzt kommt die "Post-Genomic Era", das Zeitalter der Proteine und der Biologie, jetzt geht's erst richtig los. Proteomics erlaubt funktionelle Aussagen über Proteine und deren Beitrag zu Lebensprozessen.

Experten schätzen, dass die postgenomische Ära den Rest dieses Jahrhunderts ausfüllen wird. Diese Zeitspanne ist angesichts der rasanten Entwicklung neuer Methoden und der exponentiellen Akkumulation von neuem Wissen sicherlich etwas zu lang bemessen. Auch das Genom-Projekt ist dank der Optimierung von Sequenziermethoden und der parallelen Entwicklung von passender Soft- und Hardware etwa drei bis fünf Jahre schneller fertig geworden als ursprünglich geplant. Die lange Zeitvorgabe von einem kompletten Jahrhundert zeigt jedoch den Respekt der Wissenschaftler vor dieser gigantischen Herausforderung, die um mehrere Größenordnungen gewaltiger ist als die Sequenzierung des Humangenoms.

Die Post-Genomic Ära: 100 Jahre Proteinforschung

Drei Hürden gilt es zu überwinden, will man die proteingesteuerten Prozessen und Prinzipien des Lebens verstehen. Aufgabe ist:

• "Satzzeichen" und Sinn in die Abfolge der Basenpaare zu bringen; o relevante Genen und "Genmüll" zu sortieren;
• die Bedeutung der Gene zu verstehen, oder genauer gesagt, die Funktion und Bedeutung der dazugehörigen Proteine.
• Bisher ist "nur" die Sequenz der menschlichen DNA bekannt, das heißt die Abfolge der Basenpaare ohne Punkt und Komma. Wo fangen Gene an, wo hören sie auf? Wie sind Gene organisiert? Wie werden sie gesteuert? Was sind und wie wirken "master control genes", die eine Kaskade von Genaktivierungen auslösen und zur Bildung komplexer Organe führen, zum Beispiel des Facettenauges der Insekten (2)? Wie viele Gene gibt es überhaupt? Momentan schwanken die Angaben der Experten zwischen 25 000 und 140 000.
• Nur etwa 3 Prozent des menschliches Genoms codieren für Proteine, der Rest ist "Genmüll". Dieser Begriff ist sicherlich nicht gerechtfertigt, denn die restlichen 97 Prozent der DNA haben mit hoher Wahrscheinlichkeit auch eine biologische Funktion, deren Bedeutung jedoch noch weitgehend unklar ist. Diese "nicht-codierenden Sequenzen", wie sie wissenschaftlich exakter genannt werden, umfassen die Introns, die etwa 30- bis 40-mal länger sind als Exons, und repetitive Sequenzen, die etwa 35 Prozent des gesamten Genoms repräsentieren. Etwa 0,5 Prozent des humanen Genoms bestehen aus der Basenabfolge ...CACACA...und komplementär ...GTGTGT... und 3 Prozent bestehen aus ...AAAAAA... gekoppelt mit ...TTTTTTT.... Solche repetitiven Sequenzen sind unter anderem für den Strukturerhalt von Chromosomen, das reibungslose Fortschreiten der DNA-Replikation, den korrekten Ablauf der Zellteilung und den Schutz vor Verlust relevanter Geninformationen verantwortlich.
• Kennt man Lage und Anzahl der Gene, dann erhebt sich sofort die Frage nach deren Funktion. Damit sind wir bei den Proteinen. Denn DNA ist nur ein statischer Informationsträger, der für einen Organismus eine fast unveränderliche Konstante darstellt, während Proteine "leben", dynamisch sind und vielfältige biologische Funktionen ausüben.

Big Business für Wirtschaft und Forschung

Bei Proteomics geht es aber nicht nur um ein rein akademisches Interesse, das Leben verstehen zu wollen, sondern es stecken handfeste kommerzielle Ziele mit einem Markt von vielen Milliarden Dollar dahinter, gerade wenn es um das Gesundheitswesen geht (Tabelle 2).

Mehr als fünf Millionen Deutsche leiden an genetisch bedingten Krankheiten, die über das Verständnis der dazugehörigen Gene und Proteine künftig gelindert oder geheilt werden könnten. Craig Venter hat schon über 6500 Patentanträge auf menschliche Gene und Gensequenzen eingereicht. Ob diese auch genehmigt werden, ist ungewiss, da Juristen und Politiker vor völlig neuen Herausforderungen stehen und noch nicht verbindlich entschieden haben, inwieweit Gene überhaupt patentierbar sind. Neben der direkten Korrektur defekter Gene mittels Gentherapie bietet sich über das Verständnis des Zusammenspiels der beteiligten Proteine auch die Möglichkeit an, Krankheiten auf dem Protein-Niveau in den Griff zu bekommen und dabei entweder die Translation der Proteine mittels "Anti-Sense-Technik" oder die Aktivität der Proteine direkt zu beeinflussen.

Anti-Sense-Technik

Mit der Anti-Sense-Technik soll die Bildung eines Proteins innerhalb der Zelle gezielt blockiert werden. Dazu werden kurze RNA- oder DNA-Stränge, die zu einem bestimmten Abschnitt der für das Protein codierenden mRNA komplementär, also gegensinnig ("anti-sense") sind, in Zellen eingebracht. Durch die Bindung der Anti-Sense-Moleküle an die mRNA bildet sich ein partieller RNA-DNA- oder RNA-RNA-Doppelstrang. An dieser Stelle wird das Übersetzen der mRNA-Information (Translation) in das Protein blockiert, es wird kein Protein gebildet. Die berühmte Anti-Matsch-Tomate basiert auf diesem "Anti-Sense-Trick". 1999 wurde Fomivirsenâ als erstes Anti-Sense-Medikament zur Behandlung von CMV-Infektionen bei AIDS-Patienten von der FDA zugelassen.

Jenseits des Gesundheitswesens liegen ebenso interessante wie relevante Anwendungen, zum Beispiel im Agrarbereich. Die Kenntnis der Proteine könnte zur Optimierung der Produktqualität und Ertragssteigerung sowie zu einem besseren Verständnis von Pflanzenkrankheiten und der Wirkung von Pestiziden beitragen (3). Weitere Einsatzmöglichkeiten bestehen in der Verbesserung von Fermentationsprozessen über die Identifizierung und gezielte Beeinflussung von Schlüsselenzymen von Stoffwechselwegen, an deren Ende vermarktbare Produkte stehen. Ebenso eignet sich die Proteomanalyse zur Qualitätskontrolle von rekombinanten Proteinen, um beispielsweise die Abreicherung unerwünschter Begleitproteine zu dokumentieren (4).

Einige deutsche Firmen, zum Beispiel die Firmen TOPLAB (Martinsried), Prot@gen, Xerion und NewLab (Erkrath), bieten Proteomanalysen als Dienstleistung an. NewLab führt die genannte zertifizierte Qualitätskontrolle rekombinanter Proteine durch. Eine erste Referenz-Proteom-Karte ist im Internet verfügbar (www.expasy.ch/ch2d/ch2d-top.html). Für die erfolgreiche Bearbeitung des Proteom-Projektes müssen viele Spezialisten kooperieren, zum Beispiel Biochemiker, Zellbiologen, Genetiker, Mediziner, Physiker und Informatiker. Spezialtechnologien wie Proteinreinigung, Proteinsequenzierung, Kristallographie, physikalische Chemie, Elektrochemie, Polymerchemie, Massenspektrometrie, Röntgenstrukturanalyse, Elektronenmikroskopie, Prozessautomatisierung, Robotertechnologie und Datenverarbeitung müssen synergistisch und erfolgreich kombiniert werden. Für Bioinformatiker bricht ein neues Zeitalter an. Fallen in einem größeren DNA-Sequenzierlabor pro Tag etwa 100 Gigabyte an Informationen an, so werden bei Proteomics zwischen 10- und 100-mal mehr Daten zusammenkommen, die es zu sortieren und in biologisch sinnvolle Aussagen zu überführen gilt (5).

Die biologische Dynamik der Proteine

Die unmittelbaren Ziele der Proteomanalyse, von Proteomics, sind die Auftrennung, Sichtbarmachung, Quantifizierung, Identifizierung und Charakterisierung aller Proteine einer Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt einschließlich der Erstellung von zelltypischen Proteinmustern.

Sieben biologische Tatsachen gestalten das Proteom-Vorhaben so unglaublich schwierig, dass Experten ein ganzes Jahrhundert an Forschungsaufwand dafür veranschlagen.

• Die klassische Definition, dass ein Gen für ein Protein codiert, ist nur näherungsweise gültig und spiegelt nicht den wahren biologischen Sachverhalt wieder. Erstens codieren Gene auch für ribosomale RNA (rRNA) und Transfer-RNA (tRNA). Zweitens können aus einem Gen bis zu 20 unterschiedliche Proteine hervorgehen. Verantwortlich für diese Diversifizierung ist das alternative Splicing der unreifen mRNA, das mRNA-Editing (2) und die posttranslationalen Modifikationen des primär gebildeten Proteins (Kasten "Ein Gen und viele Proteine ").
• Aus der DNA-Basenabfolge kann nicht direkt auf die Funktion des/der dazugehörigen Proteine geschlossen werden.
• Es besteht keine direkte Korrelation zwischen Genexpression, Proteinkonzentration und Proteinaktivität.
• Menge, Zusammensetzung und Aktivität der Proteine in einer Zelle ändern sich ständig und werden durch zahlreiche Faktoren beeinflusst (Tabelle 3).
• Proteine unterliegen in einer Zelle einem natürlichen Metabolismus (Protein-Turnover), denn kein Protein existiert ewig. Ist seine vorbestimmte Lebensspanne vorbei, wird das Protein intrazellulär durch einen speziell dafür vorgesehenen Verdauungsenzymkomplex (Proteasom) abgebaut und bei Bedarf durch neu gebildete Proteine ersetzt.
• Proteine bilden in Zellen komplexe dreidimensionale Cluster, so genannte supramolekulare Proteinkomplexe, die eine korrekte Proteinfunktion überhaupt erst ermöglichen. Zu derartigen Proteinkomplexen zählen Ribosomen, Transportproteine, Rezeptoren, Proteasom und Membranproteine (6). Weiterhin erlangen Proteine in der Zelle oder im Blut erst durch Assoziation mit Lipiden (Lipoproteine) oder Nukleinsäuren (Nukleoproteine, zum Beispiel Chromosomen, eine Mixtur aus DNA und Histonproteinen) ihre korrekte biologische Funktionalität.
• Proteine können zwar mehrere räumliche Strukturen (Konformation) annehmen, aber nur eine genau festgelegte Konformation garantiert die richtige biologische Funktion. Ist die Konformation verändert, ist das Protein meist inaktiv oder kann sogar Krankheiten hervorrufen. Darauf beruhen Prionen-Erkrankungen wie BSE (bovine spongiforme Enzephalitis, Rinderwahnsinn), Kuru, nvCJD (neue Variante der Creutzfeld-Jacob-Erkrankung), Fatal Familial Insomnia (tödliche familiäre Schlaflosigkeit) oder Scrapie bei Schafen.

Ein Gen und viele Proteine

Alternatives Splicing: Eukaryontische Gene bestehen aus einer Abfolge aus Exons (codierende) und Introns (nicht-codierende) Sequenzen. Auch die primär von der DNA abgelesene, unreife mRNA oder primäres Transkript genannt, besteht noch aus diesen beiden Informationselementen. Die reife mRNA, die in Proteine umgeschrieben (translatiert) wird, enthält nur noch codierende Sequenzen. Die nicht-codierenden RNA-Bereiche wurden beim Übergang von der unreifen zur reifen mRNA von speziellen Enzymen herausgeschnitten; dieser Vorgang wird RNA-Splicing genannt. Der Schneideprozess kann jedoch an unterschiedlichen Stellen der unreifen mRNA geschehen, so dass aus einer unreifen mRNA mehrere unterschiedlich gespleißte mRNA's und damit auch mehrere unterschiedliche Proteine hervorgehen können.

RNA-Editing: Vor der Translation der gespleißten mRNA können einzelne Nukleotide durch spezielle Enzyme gezielt verändert werden.

Posttranslationale Modifikationen: Das neu gebildete Protein wird innerhalb der Zelle weiter verändert, zum Beispiel glycosyliert (im endoplasmatischen Retikulum und im Golgi-Apparat), acetyliert oder phosphoryliert.

Untersucht man die Proteine einer Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt, so repräsentieren die gewonnenen Daten nur eine Momentaufnahme eines extrem komplexen und dynamischen Geschehens. Zu jedem Augenblick muss sich eine Zelle, ein Organ und der gesamte Organismus dem jeweiligen Stoffwechsel- und Wachstumsstatus dynamisch anpassen. Zu einem anderen Zeitpunkt ist ein anderes Proteom präsent. Jedem Genom können in einer vorgegebenen Lebensspanne unendlich viele Proteome zugeordnet sein.

Proteinanalyse mit 2D-Gelelektrophorese

Eine der größten Herausforderungen der Proteomanalyse liegt in der reproduzierbaren Auftrennung der bis zu 10 000 Proteine einer Zelle unter Beibehaltung der quantitativen Verhältnisse, wobei der Konzentrationsbereich zwischen 10 bis 106 Proteinkopien pro Zelle liegt. Die zur Zeit beste Methode ist die 2D-Gelektrophorese (7), bei der die Proteine in zwei getrennten Arbeitsgängen nach Ladung und Molekulargewicht getrennt werden.

Prinzip: Die Methode zur Auftrennung nach Ladung (erste Dimension) ist die isoelektrische Fokussierung; die Methode zur Auftrennung nach dem Molekulargewicht (zweite Dimension), die im rechten Winkel zur ersten durchgeführt wird, ist die SDS-Gelelektrophorese (siehe Kasten). Eine entscheidende Verbesserung erfuhr die isoelektrische Fokussierung durch die Einführung des immobilisierten pH-Gradienten (IPG), bei dem die Ladungsträger kovalent an das Polyacrylamidgel gekoppelt werden (8). Nach der Anfärbung der Proteine wird eine typisches Spot-Muster erhalten. Mehrere Firmen der Life Sciences Industrie wie Bio-Rad Laboratories, Amersham Pharmacia Biotech oder Genomic Solutions bieten eine breite Palette an Reagenzien und Geräten für die 2D-Gelelektrophorese an.

SDS-Gelelektrophorese

Proteine unterscheiden sich in Ladung, Größe und Gestalt. Bei der Auftrennung im elektrischen Feld mittels Gelektrophorese überlagern sich alle drei physikalischen Parameter, eine Aussage über einen Parameter ist nicht möglich. Will man das Molekulargewicht bestimmen, müssen Ladung und Gestalt für alle Proteine vereinheitlicht werden. Dies gelingt durch die Behandlung mit SDS (sodium dodecylsulfat). Dieses als Detergens wirkende Reagenz besteht aus einem negativ geladenen, hydrophilen Molekülköpfchen und einem langen lipophilen Molekülschwanz. Bei der Behandlung von Proteinen mit SDS lagern sich die lipophilen Molekülschwänze an die lipophilen, meistens nach innen gerichteten Bereiche des Proteinmoleküls an, während die hydrophilen Köpfchen nach außen zeigen. Im Endeffekt sind alle Proteine negativ geladen und besitzen eine einheitliche langgestreckte Form. Das Laufverhalten in der Gelektrophorese wird jetzt nur noch durch die Molekülgröße bestimmt. Im engen Maschenwerk der polymeren Gels bewegen sich bei der Auftrennung kleine Proteine schneller als große Proteine.

Probenvorbereitung: Entscheidend für das Gelingen der 2D-Geleletrophorese ist die Vorbereitung der Proteinproben. Je nach biologischem Ausgangsmaterial, zum Beispiel Zellen oder Gewebe, müssen spezielle Aufschlussmethoden gewählt und störende Begleitsubstanzen wie Polysaccharide, Lipide, Nukleinsäuren und Salze entfernt werden. Jede zusätzlicher Reinigungsschritt birgt jedoch das Risiko, Proteine zu verlieren oder zu verändern. Auch der Protein zerstörende Einfluss von natürlichen Proteasen aus dem biologischen Ausgangsmaterial muss vollständig unterbunden werden.

Bestimmung der Proteinmenge: Nach Beendigung der 2D-Gelelektrophorese wird die Menge jedes Proteins mittels Densitometrie bestimmt. Dafür müssen die Proteine zuerst im Gel angefärbt werden (9). Hierfür bieten sich mehrere, in ihrer Empfindlichkeit unterschiedliche Färbereagenzien und -prinzipien an. Der Farbstoff Coomassie Brilliant Blue eignet sich für die Visualisierung relativ großer Proteinmengen im Bereich von 105 Proteinkopien pro Zelle oder 10 ng Protein pro mm2 Gel. Wesentlich empfindlicher ist die Silberfärbung, durch die noch 103 Proteinkopien pro Zelle oder 0,01 ng Protein pro mm2 Gel nachgewiesen werden können. Die empfindlichste Methode ist der Immunoblot, mit dem noch 10 Proteinkopien pro Zelle nachweisbar sind. Alternativ könnten die Proteine auch radioaktiv markiert werden. Eine neue Generation von hochsensitiven Fluoreszenzfarbstoffen (Beispiel Sypro Orange) bindet nicht direkt an das Protein, sondern an das am Protein gebundene Natrium-Dodecylsulfat (SDS) (9).

Da Größe und Farbintensität eines Proteinflecks proportional zur Proteinmenge sind, werden genau diese beiden Parameter mittels Densitometrie optisch bestimmt und erlauben eine quantitative Aussage über die Menge des jeweiligen Proteins. Die Densitometrie ist jedoch nicht allzu präzise; jeder Wert ist mit einem Fehler von etwa 10 Prozent behaftet. Geeignete Bildverarbeitungs-Software (Beispiel Melanie, PDQuest der Firma Bio-Rad) sind bereits kommerziell erhältlich.

Die Identifizierung und Charakterisierung jedes Proteinspots gestaltet sich wesentlich schwieriger. Sehr genaue Informationen liefert die Bestimmung des Molekulargewichts mittels MALDI-TOF-MS oder ESI-MS (siehe Kasten) und das "Peptide Mass Fingerprinting", mit dem ein möglichst eindeutiger "molekularer Fingerabdruck" von Proteinen erstellt werden kann. Zuerst wird jeder Proteinspot des 2D-Gels mit einem Picking-Roboter einzeln ausgestanzt und in eine 384er Mikrotiterplatte überführt. Der Roboter kann pro Stunde bis zu 600 Proteine in Gelstückchen von 0,6 bis 1,2 mm Durchmesser isolieren (10). Danach wird jedes Protein mit speziellen Proteasen in charakteristische Spaltstücke zerlegt (Fragmentierungs-Fingerabdruck), deren Molekulargewichte wiederum mittels MALDI-TOF-MS oder ESI-MS bestimmt werden. Mit speziellen Analysetechniken wie Tandem-MS oder MALDI-Post-Source-Decay-MS können die Spaltstücke in einem gekoppelten Prozess nochmals massenspektroskopisch analysiert werden. Weitere wichtige Informationen liefert die Sequenzierung des gesamten Proteins oder der Teilstücke.

Massenspektrometrische Proteinanalyse

MALDI-TOF-MS (Matrix-assisted Laser Desorption Ionisation Time-of-Flight Mass Spectrometry): Das zu untersuchende Protein wird in eine organische Matrix eingebettet und mit einem Laserstrahl beschossen. Dabei werden Ladungen aus der Matrix losgelöst und auf das Proteinmolekül übertragen, es entstehen geladene Proteine, die in einem luftleeren Flugrohr mittels Ringelektrode beschleunigt werden und nach etwa 60 bis 100 cm Flugweg auf einen Detektor treffen. Aus der Flugzeit wird das Molekulargewicht berechnet: je schwerer das Protein, desto länger die Flugzeit. Diese Methode ist äußerst empfindlich und genau; es werden nur subpicomolare Proteinmengen benötigt und der Fehler liegt bei ± 0.05 Da pro 1000 Da. Pro Tag können mehrere 100 Proben gemessen werden (3).

ESI-MS (Electrospray-Ionisation Mass Spectrometry): Eine angesäuerte Proteinprobe wird zusammen mit organischen Lösungsmitteln unter Anlegen eines hohen elektrostatischen Potenzials im Vakuum fein zerstäubt. Durch das Abdampfen des Lösungsmittels werden die Proteintröpfchen immer kleiner und die elektrostatische Abstoßung der gleich geladenen Protein-Ionen immer stärker, bis eine "Coulomb-Explosion" eintritt, die zur Bildung von Mikrotröpfchen führt. Daraus treten mehrfach geladene Protein-Ionen aus, die im elektrischen Feld zu einem Quadrupol-Analysator fliegen. Die Peaks im Spektrum repräsentieren die verschiedenen Ladungszustände und erlauben die Berechnung der Gesamtmasse des Proteins.

Alle gewonnenen Daten (massenspektroskopische Peptidkarte, proteolytischer Fingerabdruck der Spaltstücke, Sequenzdaten) werden in einem MPI (Minimal Protein Identifier) zusammengefasst und in gewaltigen Datenbanken gespeichert (zum Beispiel www.expasy.ch). So lassen sich relativ schnell relevante Proteine identifizieren, auch solche, die posttranslational verändert wurden (Kasten "Ein Gen und viele Proteine"). Ebenso ist eine schnelle Zuordnung zu den dazugehörigen Genen möglich, die alle bekannt und in einer großen cDNA-Bibliothek eingefroren vorliegen. Auf diese Weise gelingt der Brückenschlag zwischen Genomics und Proteomics, zu der auch eine weitere neue Technologie beiträgt, die RNA-Expressionsanalyse.

Probleme: Auch wenn die 2D-Gelelektrophorese die zur Zeit gebräuchlichste Methode zur Auftrennung und Darstellung von Proteingemischen ist, so weist sie immer noch Schwachpunkte auf, an deren Lösung intensiv gearbeitet wird:

• Es können maximal 60 bis 70 Prozent aller Zellproteine dargestellt werden, da lipophile Membranproteine, Kernproteine und Proteine aus Haut und Haaren nur schwer und ungenügend gelöst und elektrophoretisch aufgetrennt werden können.
• Die 2D-Gelelektrophorese erlaubt nur eine Auftrennung von Proteinen mit einem Molekulargewicht zwischen 10 000 und 150 000 Da (Dalton). Kleinere oder größere Proteine werden nicht erfasst.
• Die gesamte Methodik der 2D-Gelelektrophorese ist bisher nur teilweise automatisierbar, was einen kostengünstigen und hohen Probendurchsatz limitiert.
• Die Aufbereitung der gewaltigen Datenmengen und die Bereitstellung von Algorithmen zur direkten Identifizierung von Proteinen nach massenspektroskopischer Analyse oder zur Zuordnung von Proteinen zu Genen sind noch nicht ausgereift.

Fazit: Es gibt noch keine optimale Methode zur Auftrennung von 10 000 Proteinen, gerade von solchen, die schlecht löslich sind und nur in wenigen Kopien pro Zelle vorliegen.

In Entwicklung befindet sich ein Kreditkarten-großer Mikrofluid 2D-Kapillarelektrophorese-Chip, der nur Nanoliter-Mengen an Proteinlösung benötigt und die Proteinproben in einer gelgefüllten Kapillare auftrennt. Durch Parallelschaltung mehrerer Chips könnten einige tausend Proben pro Tag analysiert werden (11).

Geplant ist eine automatisierte Proteinstrukturbestimmung, mit der die genaue dreidimensionale Struktur möglichst vieler Proteine mit Hilfe der kernmagnetischen Resonanz (NMR) und der Röntgenstrukturanalyse ermittelt werden soll. Voraussetzung für die proteinkristallographische Analyse ist die Etablierung einer automatisierten Proteinkristallisation in 96er Mikrotiterplatten. Das Ziel soll in einem Verbundprojekt, an dem 14 akademische und kommerzielle Gruppen in Berlin zusammenarbeiten, innerhalb der nächsten fünf Jahre erreicht werden (10).

In-vitro-Translation: Proteinsynthese ohne Zelle

Hat man ein Gen isoliert, möchte man meist das dazugehörige Protein erhalten. Dafür gab es bisher nur eine routinemäßige Möglichkeit: die Einschleusung des Gens in kultivierbare Zellen wie E. coli, Hefezellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen oder Säugetierzellen und die Produktion (Expression) des Proteins durch diese Zellen.

Seit dem Frühjahr 2000 gibt es eine höchst attraktive und innovative Alternative, die vollautomatische In-vitro-Translation. Diese revolutionierende Methode wird von der Firma Roche Diagnostics unter der Bezeichnung RTS500 (Rapid Translation System) als weltweit erstes kommerzielles System zur zellfreien Proteinexpression angeboten (12). In einem zweikammrigen Reaktionsgefäß befinden sich alle Komponenten für die Transkription und Translation, zum Beispiel Polymerasen, tRNA's, Ribosomen, Transkriptionsfaktoren und Regulationsproteine für Translation, Elongation und Termination. Die für die Neusynthese von mRNA und Proteine benötigten Bausteine (Aminosäuren, Nukleotide) sowie die Syntheseenergie werden über Diffusion durch eine semipermeable Membran dem Reaktionsansatz ständig zugeführt, ebenso wie Reaktionsnebenprodukte über Diffusion verdünnt werden. In die 1 ml fassende Reaktionskammer wird das in einen geeigneten Vektor verpackte Gen hineingegeben. Innerhalb von 12 bis 24 Stunden werden zwischen 100 und 500 µg des gewünschten Proteins in der Reaktionskammer synthetisiert.

Der Vorteil des RTS 500 ist, dass keine lebenden Zellen gentechnisch verändert und unter großem steriltechnischen Aufwand gezüchtet werden müssen und dass die Proteinreinigung erheblich vereinfacht und beschleunigt wird. Weitere Vorteile sind, dass auch zelltoxische Proteine hergestellt werden können, dass die Proteine während der In-vitro-Synthese radioaktiv oder mit Fluoreszenz markiert werden können und dass für die effizientere Reinigung künstliche Sequenzen angefügt werden können. Temperatur, Reaktionsdauer und Rührgeschwindigkeit können an dem Gerät individuell eingestellt werden. Nach Reaktionsende wird der Ansatz automatisch abgekühlt.

Protein-Chips für die Pharmakogenetik

In Analogie zu den seit etwa zwei Jahren kommerziell erhältlichen DNA-Chips (DNA-Arrays, bei denen bis zu 400 000 unterschiedliche, etwa 20 Nukleotide lange Sonden auf einer Fläche von 1 bis 2 cm² immobilisiert werden) werden seit kurzem auch Protein-Chips (Protein-Microarrays) angeboten. Bei dieser revolutionierenden Methode werden mehrere Tausend bekannte unterschiedliche Proteine auf Plastikmembranen (zum Beispiel Nitrocellulose) in winzigen Flecken (Spots) mit einem Durchmesser von wenigen Mikrometern mittels Spotting-Robotern aufgetragen (10). Mit diesen Chips kann man Protein-Protein-Wechselwirkungen erfassen. Mit Proteinen interagieren beispielsweise Proteinkinasen, Proteinliganden (an Rezeptoren), Proteintransporter oder Antikörper.

Schwerpunktmäßig ist der Einsatz in der Pharmakogenetik geplant. In Verlaufsstudien könnte man das zeitliche Auftauchen und/oder Verschwinden von Proteinen unter Medikamenteneinwirkung verfolgen. Genetische Dispositionen über die Verträglichkeit und Metabolisierung von Medikamenten können erfasst und erforscht werden. Die Detektion erfolgt mittels radioaktiv oder fluoreszenz-markierter Proteine, zum Beispiel mit Antikörpern. Bevor ein Routine-Einsatz möglich ist, müssen noch technische Schwierigkeiten hinsichtlich Produktion, Verarbeitung, Detektion und Analyse der Protein-Chips gelöst werden.

Proteom-Kartierung mit MELK

Mit der neuartigen MELK-Technologie (MELK: Multi-Epitop-Ligand-Kartierung) der Firma MelTec können molekulare Fingerabdrücke von Zelloberflächen erstellt werden (13). Art und Anordnung möglichst vieler (Glyco-)Proteine von Zelloberflächen intakter Gewebe können mit einem Zell-Scanner dargestellt werden. Das Ziel der MELK-Technologie ist die Erstellung krankheitsspezifischer Proteinmuster und die Erfassung von Musterverschiebungen unter Medikamenteneinfluss, was zu einer verbesserten Diagnose sowie einer beschleunigten und gezielteren Arzneistoffentwicklung führen soll. Diese Methode könnte auch zur Erkennung von Proteinmustern im Inneren der Zelle eingesetzt werden.

Bei dieser Methode fallen gewaltige Datenmengen an, die in der Endstufe der Technologie-Entwicklung bei etwa 80 Milliarden Bit pro Tag und Zelle liegen werden, ein weiterer "Leckerbissen" für im "Data Mining" erfahrene Bioinformatiker.

Knock-out-Mäuse für die Forschung

Eine zusätzliche Methode, die Funktion von Genen und der dazu gehörenden Proteine zu verstehen, ist die seit Jahren fest etablierte "Knock-out"-Technik. Mit gentechnischen Methoden wird bevorzugt bei Mäusen ein Gen gezielt ausgeschaltet ("ausgeknockt"); dann werden die auftretenden Defekte festgehalten sowie mit proteinchemischen Methoden das Fehlen bestimmter Proteine nachgewiesen.

Für den Knock-out Vorgang wird bei befruchteten Eizellen oder bei sehr frühen Embryonen bis zum 8-Zell-Stadium das gesunde Gen gegen das defekte Gen ausgetauscht. Entscheidend ist dabei, dass das defekte Gen nicht zufällig in das Genom eingebaut wird, sondern dass über den Prozess der "homologen Rekombination" haargenau das gesunde Gen getroffen wird. Da jedoch bei dem Rekombinationsvorgang mit hoher Wahrscheinlichkeit nur eines der beiden Gene in der diploiden Maus inaktiviert wird, also eine "gesunde" Genkopie immer noch vorhanden ist, müssen über klassische Rückkreuzungsmethoden homozygot defekte Mäuse hergestellt werden. Die amerikanische Firma Lexicon Genetics verfügt zur Zeit über 60 000 Tiere, bei denen gezielt eine Vielzahl unterschiedlicher Gene ausgeschaltet wurde (14).

Literatur

(1) Urmoneit, B., Jagd auf Gene. Pharm. Ztg. 145, Nr. 28 (2000) 11 - 16.
(2) Rehmann-Sutter, C., Was ist ein Genom? BioWorld 3 (2000) 8 - 10.
(3) Wilkins, M. R., Williams, K. L., Proteins and Proteomics. BIOforum 4, Nr. 1(2000) 10 - 12.
(4) Müllner, S., Vergleichende Proteomanalyse und Proteomics - Eine Bewertung des Technologie- und Marktpotentials für die Life-Science-Industrie. Transcript 5/8 (1999) 40 - 44.
(5) Werner, T., Genomforschung und Bioinformatik. Biologen heute (vdbiol) 1 (2000) 6 - 8.
(6) Six, A., Gene sind out - Proteine sind in. BioWorld 3 (2000) 16 - 17.
(7) Posch, A., Gauss, C., Schlüsseltechniken der Proteomanalyse: Die zweidimensionale Elektrophorese. BIOforum 23 (2000) 290 - 291.
(8) Görg, A., Postel, W., Günther, S., The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis 9 (1988) 531 - 546.
(9) Eickhoff, B., Proteomics. BioTec 6 (1999) 42 - 48.
(10) Eickhoff, H., et al., Vom Gen zur Proteinstruktur - Hochparallelisierte Ansätze zur Expressions-, Protein- und Strukturanalyse. Laborwelt 1 (2000) 19 - 23.
(11) N. N., 2D-Elektrophorese-Chip in Entwicklung. Transcript 5/6-7 (1999) 37.
(12) Gerdes, F., Zellfreie Proteinexpression im präparativen Maßstab. BioWorld 3 (2000) 60 - 61.
(13) N. N., Neues Verfahren zur Proteomkartierung hilft bei Wirkstoffsuche. Transcript 5/6-7 (1999) 39.
(14) v. Bredow, R., Müller v. Blumencron, M., Die Gen-Revolution. Der Spiegel 26 (2000) 78 - 90.

Anschrift des Verfassers:
Professor Dr. habil. Diethard Baron
Fachhochschule Weihenstephan
Fachbereich Biotechnologie
85350 Freising
diethard.baron@fh-weihenstephan.de

 

Tabelle 1: Ausgewählte Proteintypen und deren biologische Funktion

Proteintyp Funktion/Aufgabe BeispielEnzyme chemische Reaktion DNA-PolymeraseStützproteine Elastizität KollagenKontraktile Proteine Muskelarbeit Actin, MyosinSpeicherproteine Protein-Speicherung AlbuminRegulatorproteine Stoffwechselregulation HormoneRezeptoren Stoffwechselregulation HormonrezeptorSchutzproteine Immunabwehr AntikörperTransportproteine Sauerstofftransport Hämoglobin

 

Tabelle 2: Ziele von Proteomics im Gesundheitswesen

Verbesserte Prophylaxe (zum Beispiel bei Nachweis eines Krebs fördernden Proteins)Entwicklung neuer ImpfstoffeErkennen kranker Zellen über typische ProteinmusterSchnellere und genauere Vorhersage von KrankheitenFrühzeitige und genauere DiagnostikEntwicklung und Validierung neuer Medikamente zur (Kausal-)TherapieMonitoring der Krankheitsprogression oder des TherapieerfolgesMedikamentenwirkung untersuchen und verstehenEntwicklung neuer Medikamente beschleunigenResistenzen gegenüber Medikamenten verstehen und frühzeitig erkennenPathogene Mikroorganismen identifizieren

 

Tabelle 3: Faktoren, die Expression, Zusammensetzung und Funktion von Proteinen steuern

ZellalterDifferenzierungsgradErnährungszustand der ZellePhase des ZellzyklusStressfaktoren (zum Beispiel UV- oder Röntgenstrahlung, Hitze, Kälte, Stresshormone, Mangelernährung, Viren, Krebs)Tages- und JahreszeitUmweltfaktoren (zum Beispiel Chemikalien, Elektrosmog, radioaktive Strahlung, Ozon, Schwermetalle)

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