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Mit Mikrokugeln auf Spurensuche

25.02.2002
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PHARMAZIE

Mit Mikrokugeln auf Spurensuche

 

PZ  Ein neues Verfahren zur Analyse der biologischen Effekte von potenziell wirksamen Substanzen könnte künftig die Arzneistoffentwicklung um ein Vielfaches beschleunigen. Das so genannte Multiplex-System funktioniert mit einem "Flüssig-Protein-Chip" und einem automatisierten Protein-Analyse-Verfahren, das die simultane quantitative und qualitative Analyse von bis zu 100 verschiedenen Proteinen oder Peptiden in einer einzigen Probe erlaubt.

Neue Methoden der kombinatorischen Chemie, der Genomforschung und des automatisierten Hochdurchsatz-Screenings sorgen für eine stetig wachsende Zahl von Substanzen mit potenziell pharmakologischen Wirkungen. Um die pharmakologische und therapeutische Relevanz einer identifizierten Substanz beurteilen zu können, müssen ihre Wirkungen auf komplexe zelluläre Zusammenhänge und spezifische Schlüsselmoleküle innerhalb oder außerhalb der Zellen in nach geschalteten Testreihen eingehend untersucht werden: Welche zellulären oder extrazellulären Proteine werden verändert? Ändern sich Menge oder der funktionelle Status bestimmter Boten- und Signalstoffe? An welchen Stellen greifen die Substanzen in das Stoffwechselgeschehen ein? Zentrale Fragen, die über die weitere Karriere der Kandidaten entscheiden.

Diese Fragen ließen sich bislang nur in umfangreichen und zeitaufwändigen Einzeltests beantworten. Ein System von der auf Analytik spezialisierten Firma Bio-Rad erlaubt seit kurzem die simultane quantitative und qualitative Untersuchung einer großen Zahl von interagierenden Schlüsselmolekülen in einem einzigen Experiment. Mit dem vollständig automatisierten Analyseverfahren des amerikanischen Bioanalytikunternehmens können simultan bis zu 100 verschiedene Proteine und Parameter in nur einer Probe untersucht werden. Das System basiert auf dem Prinzip des Fluoreszenzimmunoassays, das heißt dem Nachweis einer Substanz durch Antikörper, die mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert sind und so quantitativ bestimmt werden können.

Basis des Multiplex-Tests bilden kleinste Mikrokugeln aus Kunststoff, die mit spezifischen Antikörpern gegen die zu untersuchenden Proteine beschichtet sind. Jede der Mikrokugeln trägt dabei eine spezifische "spektrale Adresse", die durch das Verhältnis von zwei Fluoreszenzfarbstoffen charakterisiert ist, mit denen die Mikrokugeln dauerhaft gefärbt sind. Insgesamt können so bis zu 100 verschiedene Mikrokugel-Sets codiert werden. Jedes der Sets ist dabei mit einem unterschiedlichen Antikörper gegen jeweils eines der zu untersuchenden Proteine bestückt. Mit Hilfe der verschiedenen Mikrokugeln laufen im Test simultan bis zu 100 verschiedene quantitative und qualitative Analysen, die sich separat auswerten lassen. Wird eine Probe -beispielsweise ein Zellextrakt nach Behandlung der Zellen mit einer potenziellen Wirksubstanz mit den Mikrokugeln inkubiert, werden die verschiedenen Proteine aus dem Zellextrakt an die entsprechenden Antikörper auf der Oberfläche der jeweiligen Mikrokugeln gebunden.

Um die gebundene Menge zu messen, wird ein zweiter Antikörper gegen die jeweils untersuchten Proteine zugegeben, der mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff markiert ist. Da die Menge dieses markierten Antikörpers proportional zur Menge des gebundenen Proteins ist, lässt sich die Konzentration des Eiweißes direkt anhand der Fluoreszenz ermitteln.

Zur Messung von Menge und Art der gebundenen Proteine werden die Mikrokugeln zunächst automatisch in einer speziellen Kammer, dem Flüssig-Protein-Chip, mit einem Flüssigkeits-Strömungsverfahren separiert und nacheinander einzeln in eine spezielle Leseeinheit des Systems transportiert. In der Leseeinheit wird zunächst die jeweilige spektrale Codierung der Mikrokugeln nach Anregung mit einem Diodenlaser bestimmt. Dadurch erfolgt die Zuordnung des Messergebnisses zu einem spezifischen Antikörper. In einem zweiten Schritt wird die Menge des gebundenen Proteins über die Fluoreszenz des zweiten Antikörpers nach Anregung mit einem sogenannten Reporter-Laser bestimmt. Die installierte Software des computergesteuerten Systems errechnet aus den gemessenen Fluoreszenzwerten die Gesamtkonzentrationen der entsprechenden Proteine.

Da für den Test standardisierte Mikrotiterplatten verwendet werden, auf die bis zu 96 verschiedene Proben aufgetragen werden können, ist mit dem neuen Verfahren theoretisch die Analyse von 9.600 Einzelparametern innerhalb kurzer Zeit mit kleinsten Probenvolumina auf einer einzigen Testplatte möglich.

 

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