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Pharmazie

17.01.2000  00:00 Uhr

-PharmazieGovi-VerlagROSSKASTANIENSAMENEXTRAKT

Validität von Immunoassays bei Wirkstoffgemischen fraglich

von Dieter Loew, Wiesbaden, und Walter Schwankl, Neumarkt

Für Roßkastaniensamenextrakte (RKSE) gilt als wirksamkeitsbestimmendes Prinzip das Triterpensaponin-Gemisch Aescin. Dieses kann derzeit in biologischen Flüssigkeiten wegen seiner schlechten chromophoren Eigenschaften nur mit immunologischen Analysemethoden, wie Radioimmunoassays (RIA) oder Enzym Linked Immuno Sorbent Assays (ELISA) (1, 2, 3) erfasst werden, und zwar über seine Unterfraktion b-Aescin.

Zusammenfassung

Für generische Phytotherapeutika erscheint grundsätzlich dann ein Bioäquivalenznachweis möglich, wenn wirksamkeitsestimmende Inhaltsstoffe aus dem in seiner Gesamtheit als Wirkstoff angesehenen Extrakt identifiziert sind. Bei analogen Zubereitungen aus Roßkastaniensamenextrakten (RKSE) kann das als wirksames Prinzip angesehene Triterpensaponin-Gemisch Aescin wegen seiner schlechten chromophoren Eigenschaften derzeit jedoch nur über seine Unterfraktion b-Aescin mit immunologischen Analysemethoden aus dem variablen Wirkstoffkomplex erfasst werden. Die aus den vorliegenden Bioäquivalenzstudien verfügbaren, radioimmunologisch bestimmten, pharmakokinetischen Meßwerte wurden in Abhängigkeit von dieser Wirkstoffanalytik und der inneren Wirkstoffzusammensetzung vergleichend bewertet. Für die präparatespezifischen Extrakte kann eine deutliche Inkonstanz der erhaltenen pharmakokinetischen Meßwerte für b-Aescin aufgezeigt werden. Diese Aussage gibt sowohl unter analytischen als auch unter regulatorischen Gesichtspunkten Anlass, erneut darauf zu verweisen, dass bei der Bioverfügbarkeitsbestimmung die analytischen Reaktionsmechanismen der verwendeten Nachweismethode immer im Zusammenhang mit der variablen Zusammensetzung dieser komplexen Wirkstoffe gesehen werden sollten. Die extraktspezifische, quantitative Variabilität der inneren Zusammensetzung der zu analysierenden Aescine läßt unterschiedliche Messergebnisse in Abhängigkeit von der jeweiligen Affinität des Antikörpers zu den auftretenden Aescin-Fraktionen erwarten. Die Validität der in den Studien mit gleicher RIA-Analytik erhaltenen pharmakokinetischen Meßwerte für b-Aescin und die daraus resultierenden Bioäquivalenzaussagen müssen daher zumindest dann in Frage gestellt werden, wenn keine chargenspezifische RIA-Validierung für die zu untersuchenden Test- und Referenzpräparate vorliegt.

Aescin ist ein komplexes Gemisch verschiedener, chemisch sehr ähnlicher Triterpenglykoside. Aglyka dieser Saponine sind Barringtogenol C und Protoaescigenin. Zu unterscheiden sind das schwer lösliche, aus über 30 Einzelverbindungen zusammengesetzte b-Aescin, ein C-21- und C-22-Diester, das leicht wasserlösliche Kryptoaescin, das durch spontane Wanderung der Acetylgruppe vom C-22 zum C-28 entsteht sowie a-Aescin, das Gleichgewichtsgemisch dieser beiden stellungsisomeren Diester (4).

Bei solchen pflanzlichen Zubereitungen werden jedoch der Extrakt und nicht einzelne Bestandteile oder Inhaltsstoffe des Extraktes als Wirkstoff deklariert, selbst wenn für einen dieser Inhaltsstoffe eine pharmakologische Wirkung im Sinne des Indikationsanspruchs nachgewiesen wurde.

RKSE-haltige Fertigarzneimittel werden nach DAB 10 auf eine Gesamttriterpen-Menge (16 bis 20 Prozent), berechnet als Aescin, normiert, wobei die im Gemisch quantitativ variablen Anteile der einzelnen Saponine unberücksichtigt bleiben müssen.

Bioäquivalenzstudien liefern unterschiedliche Ergebnisse

Mit der Etablierung eines b-Aescin – Radioimmunoassays (RIA, (2)) zur Bestimmung dieser pharmakologisch aktiven Teilfraktion des Saponin-Gemisches eröffnete sich für generische Phytopharmaka aus RKS-Extrakten die Möglichkeit von Bioverfügbarkeitsuntersuchungen, die letztendlich in der regulatorische Forderung (6) zum Nachweis der Bioäquivalenz von analog zusammengesetzten, RKSE-Fertigarzneimittel zum monographierten, retardierten Referenzprodukt (5) resultierte. Inzwischen wurde mit dieser Analytik in neun vergleichenden Studien die Bioverfügbarkeit von Aescin-haltigen Präparaten im single- (7, 8, 9a, 9b) und multiple-dose-Design (9a, 9b, 10, 11, 12) untersucht. In allen Studien wurde unter identischen Analysebedingungen der Gehalt an b-Aescin im Plasma radioimmunologisch bestimmt. Als Referenzpräparat diente immer die gleiche Monographie-konforme Retardkapsel-Zubereitung.

Aufgrund der analogen Untersuchungs- und Analysebedingungen innerhalb einiger Studien lassen sich daher die pharmakokinetischen Kenngrößen von (b-) Aescin unter Einbeziehung der Spezifität der verwendeten radioimmunologischen Methode und der variablen inneren Zusammensetzung von aescinhaltigen Extrakten zu vergleichend bewerten.

In den unter diesen Gesichtspunkten herangezogenen vier Steady-state-Studien (9a, 9b, 10, 11, 12) mit marktüblichen Handelschargen analog zusammengesetzter RKSE-Fertigarzneimitteln wurden die Darreichungsformen Dragee (11), Retardtablette (9a, 9b), schnellfreisetzende (12) sowie schnellfreisetzende/magensaftresistente Filmtablette (10) mit dem als Retardzubereitung charakterisierten Referenzpräparat verglichen. Soweit zusätzliche, biopharmazeutische Untersuchungen der Test- und Referenzzubereitungen durchgeführt wurden (11, 21), konnte gezeigt werden, dass trotz gleicher deklarierter Gesamttriterpen-Menge (berechnet als Aescin) die innere Zusammensetzung signifikanten Extrakt- beziehungsweise Chargen-spezifischen Schwankungen unterworfen ist.

Beim Vergleich der Studien (9a, 9b, 10, 11, 12) werden unter Steady-state-Bedingungen deutliche Inkonsistenzen der pharmakokinetischen Kennwerte von b-Aescin innerhalb und zwischen den Untersuchungen deutlich. Der Vergleich zwischen den Studien (9a, 9b, 11) zeigt zum Beispiel für das Referenzpräparat Konzentrationsunterschiede um den Faktor 1,5 (Cmax-Werte zwischen 6,5 und 16,7 ng/ml). Innerhalb der Einzelstudie (11) ergibt sich zwischen Test- und Referenzpräparat eine mit steady-state-Bedingungen nicht in Einklang stehende Ausgangsniveauverschiebung des Konzentrations-Zeit-Verlaufs. Die pharmakokinetischen Kenngrößen AUC und Cmax für b-Aescin belegen eine große Variabilität der entscheidenden pharmakokinetischen Parameter für das Referenzpräparat und die Inkonsistenz innerhalb der Studien demonstrieren. Bei der Diskussion dieser uneinheitlichen pharmakokinetischen Kenngrößen muss daher insbesondere die Frage untersucht werden, inwieweit vor dem Hintergrund unterschiedlicher Zusammensetzungen der Zubereitungen und bekannter Kreuzreaktivitäten, Ergebnisse mit diesen radioimmunologischen Verfahren überhaupt aussagekräftige und valide Daten liefern.

Vergleichende Bewertung pharmakokinetischer Messwerte

Für die kritische Bewertung sollen Messergebnisse aus den Single-dose-Studien (7, 8, 9a, 9b) unter dem Gesichtspunkt der vernachlässigten, nachfolgend aufgezeigten analytischen Problematik unberücksichtigt bleiben. Die für Aescin beschriebenen und in diesen Studien gefundene große inter- und intraindividuelle Schwankungen der Serumkonzentrationen führten lediglich dazu, das Saponingemisch als hoch variable Substanz zu diskutieren. Daraus wurde zwingend abgeleitet, pharmakokinetische Studien für RKSE-Zubereitungen im steady state mit erweiterten Akzeptanzkriterien durchzuführen (13).

Da die in den jeweiligen Multiple-dose-Studien (9a, 9b, 10, 11, 12) erhaltenen Messwerte für b-Aescin nach ausreichender Aufsättigungsdauer identischer Wirkstoff-Dosierungen im steady state gemessen wurden, müsste deren hohe Variabilität zunächst den unterschiedlichen Darreichungsformen mit ihren spezifischen intragastralen Freisetzungs-Verhalten zugeschrieben werden. Betrachtet man jedoch nur die Pharmakokinetik des in allen Studien gleichen Referenzpräparates, so müssen andere Ursachen für die schwankenden Werte diskutiert werden, da beim Vergleich durchführungsidentischer Studien selbst das Referenzpräparat mit sich bioinäquivalent wäre (9a, 9b, 11). Die relativen Unterschiede für Cmax und AUC liegen bei bis zu 200 Prozent.

Formal ist bei gleicher biopharmazeutischer Qualität im steady state ein bioäquivalentes Verhalten der analog zusammengesetzten Fertigarzneimittel zu erwarten. Erklärungsansätze, wie eine für die intestinale Absorption von höheren Aescin-Dosen hypothetisierte Invasionskinetik nullter Ordnung (14) oder die niedrige Resorptionsrate der Aescin-Saponine von 10 bis 15 Prozent (14, 15), sind bei ausreichender Aufsättigung ausgeschlossen. Selbst wenn unter diesen Gegebenheiten geringe individuelle Absorptionsunterschiede in größeren Messwertdifferenzen zum Ausdruck kämen, könnten damit auch unter biometrischen Aspekten die unterschiedlichen Werte nicht ausreichend erklärt werden.

Keine absolute Spezifität mit Immunoassay

Für den RIA werden Tritium-markiertes b-Aescin und ein Antikörper gegen ein definiertes b-Aescin als spezifisches Bindungsprotein verwendet (1, 2). Das analytische Hauptproblem dürfte im Antikörper liegen, der keine konstante Affinität und Spezifität besitzt. Absolute Spezifität ist in einem Immunoassay nicht möglich, weil es mit Metaboliten oder chemisch verwandten Verbindungen zu Kreuzreaktionen kommen kann. Daher sollte bei der Gewinnung der spezifischen Antikörper darauf geachtet werden, dass die Molekülregion, in der sich Hapten und Störkomponente am stärksten unterscheiden, im Haptenteil des Immunogens so weit wie möglich von der Bindungsstelle des Haptens an den Carrier entfernt sind (16). In dem verbesserten RIA (17) wurden diese Anforderungen zwar bereits berücksichtigt (C-5 Spacer), doch können a- oder b-Aescine unterschiedlicher Provinienz signifikante Kreuzreaktionen zeigen (2, 9a, 9b).

Die während der Immunisierung erzeugten Immunglobuline sind sehr variabel (16). Insbesondere die Affinität der einzelnen Stoffe zum verwendeten Antikörper spielt oft eine ganz besondere Rolle: So kann zum Beispiel eine um den Faktor 10 geringere Bindungskraft eines Antikörpers zu irrelevanten Haptenen ein gleich hohes Signal im Assay produzieren, wenn die Konzentration ähnlicher Begleitsubstanzen etwas steigen und dafür der Gehalt der gesuchten Hauptkomponente sinkt. Diese Fehlreaktionen können nur dann minimiert werden, wenn in einer ausführlichen Validierung alle in der Probe vorkommenden Derivate oder Metaboliten des nachzuweisenden Antigens auf Kreuzreaktionen und ihre Affinität zum Antikörper geprüft werden. Dieser Gesichtspunkt sollte vor allem bei einem Immunoassay auf Aescine berücksichtigt werden.

Das in dem Triterpensaponin-Gemisch enthaltene b-Aescin setzt sich aus über 30 Einzelverbindungen zusammen. Nach verschiedenen Untersuchungen (11, 18, 19, 21) zur inneren Zusammensetzung unterschiedlicher Extrakte unterliegen die einzelnen b-Aescinfraktionen signifikanten quantitativen Unterschieden, die bei der Deklaration der Gesamttriterpenmenge nicht zum Ausdruck kommt. So konnten Wagner et al. bei Untersuchungen von RKSE-Chargen unterschiedlicher Herkunft nachweisen, dass die Chromatogramme zwar qualitativ gut übereinstimmten, sich aber quantitativ deutlich unterschieden. Diese Schwankungen sind offenbar auf wechselnde Anteile Angelika- beziehungsweise Tiglinsäure-haltiger Saponine zurückzuführen.

Studienergebnisse in Frage stellen

Die regulatorische Substanzbeschreibung von Aescin als chemisch definierte Monosubstanz, verleitete sicher dazu, die komplexe Zusammensetzung des Gemisches zu wenig zu beachten. Es muss letztendlich (selbst-)kritisch angemerkt werden, dass bei der bekannten quantitativen Variabilität der einzelnen Saponinfraktionen im Aescin und der Spezifität immunulogischer Bestimmungsmethoden, eine methodenkritische Bewertung der vorliegenden Studien bereits früher, also vor Einleiten solcher Untersuchungen hätte einsetzen müssen. Das gilt auch für die Forderung von Bioäquivalenznachweisen für RKS-haltige Zubereitungen.

Die mit dieser Analytik gewonnenen Studienergebnisse als wesentliches regulatorisches Entscheidungskriterium für analog zusammengesetzte Fertigarzneimitteln muss daher dann in Frage gestellt werden, so lange keine Extrakt-/Chargen-spezifische Assay-Validierung vorliegt.

Retard oder nicht Für das als Retardzubereitung charakterisierte Referenzpräparat kann die verzögerte Wirkstofffreisetzung weder aus den pharmakokinetischen Ergebnissen (tmax) noch aus biopharmazeutischen In-vitro-Befunden (20, 21) abgeleitet werden. Auch die Magensaftresistenz im Sinne einer modifizierten Wirkstofffreigabe kann für das Referenzpräparat nur sehr eingeschränkt angenommen werden, da es in anderen Untersuchungen (Wirkstofffreisetzung nach DAB 10, V.5.4., Blattrührmethode) innerhalb von zwei Stunden im künstlichen Magensaft zu 60 Prozent freigesetzt war (20).

Diese Ergebnisse sind jedoch nach dem derzeitigen Erkenntnisstand ohne therapeutische Relevanz. Alle dazu publizierten Daten weisen Halbwertszeiten auf, die zeigen, dass der Wirkstoff so langsam eliminiert wird, dass eine verzögerte Freisetzung aus der Darreichungsform keinen Einfluss auf die Plasmaspiegel hat. Die monographierte Forderung einer retardierten Darreichungsform scheint sowohl unter pharmakokinetischen als auch unter therapeutischen Gesichtspunkten ohnehin unbegründet und ist heute nicht mehr haltbar.

Extrakt-spezifische Validierung oder neue Verfahren nötig Wahrscheinlich führen hauptsächlich die nicht konstante innere Zusammensetzung des RKS-Extrakts sowie der nicht extraktspezifisch validierte Immunoassay zu dem unterschiedlichen Ergebnisse. Der auf ein bestimmtes b-Aescin validierte RIA ist für die Variabilität der Aescin-Strukturanaloga zu spezifisch und seine Operationscharakteristik in unterschiedlichen Extrakten nicht bekannt. Daher muss es bei Messungen in unterschiedlichen RKS-Extrakten oder Aescinen mit einem nicht extraktspezifisch validierten RIA zu Messungenauigkeiten kommen. Bei RIA-Untersuchungen in solchen Stoffgemischen mit unterschiedlichen Antikörpern/Immunogenen oder Tracern sind pharmakokinetische Messwerte nicht vergleichbar. Daraus resultierende Aussagen zur Bioäquivalenz-Aussagen müssen folglich grundsätzlich in Frage gestellt werden. Vor diesem Hintergrund kann auch die Frage vorerst nicht klar beantwortet werden, ob Aescin als pharmakokinetisch sehr variable Substanz einzustufen ist.

Ein möglicher, jedoch aufwendiger Ausweg wäre zunächst jeweils eine Extrakt-spezifische Validierung des etablierten RIA. Ansonsten könnte nur ein anderer nicht immunreaktiver, empfindlicher Assay für Aescin wie zum Beispiel LC-MS/MS entwickelt werden (23, 24). Es ist also geboten, erneut darauf zu verweisen, dass bei der Bioverfügbarkeitsbestimmung die analytischen Reaktionsmechanismen der verwendeten Nachweismethode immer im Zusammenhang mit der variablen Zusammensetzung dieser komplexen Wirkstoffe gesehen werden sollten.

Literatur:

  1. Lehtola, T., Huhtikangas, A., Radio-immunoassay of aescin, a mixture of triterpene glycosides. J Immunoassay 11 (1990) 17 - 30.
  2. Kunz, K., Validation Report, IBFR, München, 1996.
  3. Hentschel, Ch., et al., Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von b-Aescin in humanem Serum. Pharmazie 49 (1994) 929.
  4. Beck, M,. Aesculus. in: von Bruchhausen, F., et al., (Hrsg.), Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis. 5. Aufl., Bd. 5, Springer, Heidelberg, Berlin, New York 1995, S. 108 - 118.
  5. Monographie Hippocastani semen (Roßkastaniensamen) / Trockenextrakt (DAB 10) aus Roßkastaniensamen. BAnz. Nr. 71 v. 15.04.94.
  6. Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte: Bekanntmachung einer Ergänzung zur 7. Bekanntmachung gemäß § 26 Absatz 3 des Arzneimittelgesetztes (AMG) über die Zulassung nach § 21 AMG und die Verlängerung der Zulassung von Arzneimittel nach § 105 AMG (Bioverfügbarkeit / Bioäquivalenz) v. 03. 01.96. BAnz. Nr. 23 v. 02.02.96.
  7. Schrader, E., et al., Vergleichende Untersuchungen zur Bioverfügbarkeit von b-Aescin nach oraler Einmalverabreichung zweier Roßkastaniensamenextrakt enthaltender, galenisch unterschiedlicher Darreichungsformen. Pharmazie 50 (1995) 623 - 627.
  8. Dittgen, M., et al., Untersuchung zur Bioverfügbarkeit von b-Aescin nach oraler Verabreichung verschiedener Darreichungsformen. Pharmazie 51 (1996) 608 - 610.
  9. a. Oschmann, R., et al., Pharmakokinetik von b-Aescin nach Gabe verschiedener Aesculus-Extrakt enthaltender Formulierungen. Pharmazie 51 (1996) 577 - 681.
    b. Biber A., et al., Pharmakokinetik von b-Aescin nach Gabe verschiedener Aesculus-Extrakte enthaltender Formulierungen in: Phytopharmaka II, In: Loew, D., Rietbrock, N. (Hrsg.), Steinkopff Darmstadt 1996, S. 49 - 54.
  10. Kunz, K. et al., Bioavailability of escin after administration of two oral formulations containing Aesculus extracts. Arzneim. Forsch/Drug Res. 48 (II) (1998) 822 - 825.
  11. Schrödter, A., et al., Zur Validität radioimmunologisch bestimmter Bioverfügbarkeitsdaten von b-Aescin in Roßkastaniensamenextrakten. Arzneim. Forsch/Drug Res. 48 (II) (1998) 905 -909.
  12. Loew D, Bethge, S., Schwedte, H., (1999) Publikation in Vorbereitung.
  13. Sörgel F., et al., Bioäquivalenzuntersuchungen von Phytopharmaka – Grundlagen, Design, statistische Verfahren und moderne bioanalytische Methoden, In Phytopharmaka II, In: Loew, D., Rietbrock, N. (Hrsg.), Steinkopff Darmstadt 1996, S. 15 - 48.
  14. Felix, W., Zur Wirkungsweise der Ödemprotektiva. Phlebologie 28 (1999) 105 - 111.
  15. Hitzenberger, G., Die therapeutische Wirksamkeit des Roßkastaniensamenextraktes. WMW 139 (1989) 385 - 389.
  16. Peinhardt, G., Arzneimittelanalytik mittels Radioimmunoassay. PZ-Prisma 5 (1998) 268 - 276.
  17. Kunz, et al., Bioverfügbarkeit von b-Aescin nach oraler Gabe zweier Aesculus-Extrakt enthaltender Darreichungsformen an gesunden Probanden. Pharmazie 46 (1991) 145.
  18. Reger, H., Die HPLC-Analyse der Saponindrogen Hippocastani semen, Primula radix und Hedera folium und daraus hergestellter Arzneipräparate. Dissertation, Fak. Chemie und Pharmazie, LMU München 1987.
  19. Wagner, H., Reger, H., Bauer, R., Saponinhaltige Drogen und Fertigarzneimittel. DAZ 25 (1985) 1513 - 1518.
  20. Kolkmann, R., Böttcher, F., Galenik und Freisetzung von Aescin. Pharm. Ztg. 139 (1994) 77.
  21. Denzel, K., Hofmann, A.. Abschlußbericht: Untersuchung zum Freisetzungsverhalten von galenisch unterschiedlichen RKSE-Zubereitungen. Phytos GbRmbH, Neu-Ulm, Interne Dokumentation Bionorica GmbH, 1997.
  22. Loew, D. et al., Problems in studying the bioavailability of escin-containing extracts. A method-critical pharmaco-kinetic review. Zur Publikation eingereicht, 1999.
  23. Rüsing, G., et al., LC-MS/MS - An analytical tool to analyze plant extracts for the pattern of content – Echinacea and b-Aescin. 2nd International Congress on Phytomedicine, Munich, Abstract booklet, (1996) P-34.
  24. Griffini, A., Lolla, E., Peterlongo, F. Liquid chromatography-thermospray mass spectrometry analysis of b-escin. Fitoterapia 68 (1997) 520 - 526.

Anschrift der Verfasser:
Professor Dr. Dr. Dieter Loew,
Am Allersberg 7,
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