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Eine adaptierte Methode aus dem Brauereiwesen

18.02.2002
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GERBSTOFFBESTIMMUNG

Eine adaptierte Methode aus dem Brauereiwesen

von Dietmar Heigl und Gerhard Franz, Regensburg

Bislang gibt es mehr oder weniger befriedigende Methoden, um Gerbstoffe in Extrakten quantitativ zu erfassen. Die im Nachtrag 2000 des Europäischen Arzneibuchs enthaltene Hautpulvermethode ermöglicht eine Erfassung des Gesamtpolyphenolgehaltes, ist aber relativ unspezifisch und störanfällig. Chromatographische Verfahren weisen zwar eine höhere Spezifität auf, die Trennungen sind jedoch oft unzureichend und erforderliche Referenzsubstanzen nicht erhältlich. In der Lebensmittelanalytik bedient man sich der Trübungsmessung. Sie ermöglicht eine Bestimmung der Gesamttannoide.

Unter dem Begriff Tannoide versteht man in der Lebensmittelchemie den Anteil an Polyphenolen, der mit Polyvinylpyrrolidon (PVP, durchschnittliches Molekulargewicht 700.000 Dalton) fällbar ist (3). Die nephelometrischen Methoden werden zur Analytik der in Gersten- und Hopfenextrakten enthaltenen Gerbstoffe (Biertannoide) und in der Wein- und Fruchtsaftanalytik eingesetzt (4, 5). Für diese Trübungsmessungen gibt es im Handel Nephelometer (Tannometer), die eine rasche und gut reproduzierbare Bestimmung von mit PVP fällbaren Gerbstoffen ermöglichen.

Bisher wurden Tannometer ausschließlich im Lebensmittelbereich eingesetzt. Es existieren bislang nur wenige Erfahrungen über deren Einsatz in der Arzneipflanzenanalytik (6). Daher sollte die Möglichkeit der Gerbstoffbestimmung durch Trübungsmessung bei entsprechenden Drogen im Vergleich zur arzneibuchkonformen Methodik untersucht werden.

Interaktion zwischen Polyphenolen und PVP

PVP ist eine polymere, gut wasserlösliche Verbindung, bei der die Stickstoffatome der Pyrrolidon-Ringe an eine Polymethylen-Kette kovalent gebunden sind. Die enthaltenen Carbonylgruppen stellen die funktionellen Einheiten dar, die als Elektronendonatoren Wasserstoffbrücken zu Polyphenolen ausbilden können und Interaktionen mit phenolischen OH-Gruppen ergeben.

Zu Beginn der Messung liegt ein Überschuss von Polyphenolen im Vergleich zu PVP vor, sodass alle PVP-Moleküle von gelösten Polyphenol-Molekülen umgeben sind. Dies führt zu einer Verdrängung von Wassermolekülen und damit zu einer verringerten Löslichkeit des PVP, woraus eine Trübung resultiert. Im Zustand des Gleichgewichtes zwischen Tannin- und PVP-Molekülen erlangt das PVP schrittweise seine Löslichkeit, da nicht mehr alles PVP mit gebundenen Tanninmolekülen gesättigt ist. Die PVP-Konzentration im Maximum der Messkurve entspricht somit der Tanninkonzentration. Diese kann mit einer Software automatisch berechnet werden.

Das Messprinzip

Das Tannometer besteht aus einer automatischen Perfusorspritze, mit der PVP-Lösung exakt zudosiert werden kann und einer temperaturkontrollierten Messzelle. In einer Küvette werden die Probenlösung, das sind in der Regel wässrige Extrakte, gesättigte Ammoniumsulfatlösung und Wasser mit dem integrierten Magnetrührer gemischt und in die thermostatierte Messzelle gebracht. Nach der automatischen Zugabe von PVP-Lösung wird die Intensität des durch unlöslichen Verbindungen gestreuten Lichts erfasst. Die resultierende Trübungskurve wird per EDV über eine eingebaute serielle Schnittstelle aufgezeichnet. Man erhält eine Glockenkurve mit einem deutlichen Maximum, die je nach untersuchtem Extrakt mehr oder weniger symmetrisch verläuft.

Untersuchte Drogenextrakte

Die Herstellung der zu untersuchenden gerbstoffhaltigen Drogenextrakte erfolgt durch Heißwasserextraktion nach der Vorschrift (2.8.14) im Europäischen Arzneibuch (8). Zur Herstellung der PVP-Lösung werden 0,400g PVP in einem Liter destillierten Wasser gelöst (0,04-prozentig). Mit dieser Lösung wird eine Perfusorspritze blasenfrei befüllt. In eine Küvette mit der Schichtdicke von 2 cm werden 0,200 ml Drogenextrakt, 3,0 ml Wasser und 0,800 ml gesättigte Ammoniumsulfatlösung pipettiert und gemischt. Nach Einstellen der Küvette in die Messkammer erfolgt bei einer Temperatur von 25 °C die automatische Zugabe von PVP mittels einer Perfusorspritze mit einer Geschwindigkeit von 1,8 ml/h. Durch den integrierten Magnetrührer wird die Flüssigkeit gut durchmischt.

Den Verlauf der Trübung zeichnet ein Computer auf, wobei die Intensität der Trübung in EBC-Einheiten (European Brewing Convention) angegebenen wird. Die Resultate liegen schließlich in der Einheit mg PVP pro Liter Probe vor, wobei die zudosierte Menge PVP dem relativen Tanningehalt proportional ist. Die Versuch dauert ohne Extraktherstellung circa 15 Minuten.

Der Verlauf der Trübungskurven ist für die Drogen charakteristisch und bei Untersuchung unterschiedlicher Chargen relativ konstant.

Die Trübungskurve von Hamamelisblättern zum Beispiel verläuft symmetrischer als die Kurve von Eichenrinde oder Ratanhiawurzel. Die symmetrische Form deutet auf wenig oder mittelkondensierte Gerbstoffe hin, während ein asymmetrischer Kurvenverlauf für einen großen Anteil an hoch kondensierten Polyphenolen spricht (3). Hamamelisblätter enthalten einen relativ hohen Anteil an hydrolysierbaren beziehungsweise niedrig kondensierten Gerbstoffen (10), was sich in symmetrischen Kurven äußert. Tormentillwurzelstock und Ratanhiawurzel mit einem hohen Anteil an kondensierten Gerbstoffen ergeben dagegen einen relativ unsymmetrischen Verlauf.

Die Reproduzierbarkeit der Tannometer-Methode ist bei geringen Standardabweichungen der Messwerte gut (siehe Kasten). Die Messwerte verlaufen über einen weiten Konzentrationsbereich streng linear. Es wurde dabei nicht ein höher konzentrierter Extrakt, sondern eine steigende Extraktmenge eingesetzt; das heißt die ursprünglich vorgegebenen 3 ml Wasser ersetzt man entsprechend durch steigende Mengen an wässrigem Drogenextrakt.

 

Mehrfachmessung eines Extraktes aus Hamamelisblättern per Tannometer

Tannoidgehalt:
29,49 mg/l
29,70 mg/l
29,83 mg/l
31,30 mg/l
30,32 mg/l
30,95 mg/l
31,92 mg/l
Mittelwert: 30,27 mg/l
Standardabweichung: 0,91
Variationskoeffizient: 3,02 Prozent

 

Temperatur und Dosiergeschwindigkeit

Die entstehende Trübung ist vor allem von den Parametern Messtemperatur und Dosiergeschwindigkeit abhängig. Es wurden die Auswirkungen von Veränderungen dieser Parameter auf das Messergebnis untersucht. Das Vermessen eines Extraktes aus Gänsefingerkraut bei einer konstanten Dosiergeschwindigkeit von 2,5 mg/l, jedoch unterschiedlichen Temperaturen ergab die in Tabelle 1 dargestellten Werte.

 

Tabelle 1: Messergebnisse in Abhängigkeit der Temperatur

20°C

33,45 mg/l

25°C

31,72 mg/l

30°C

30,46 mg/l

jeweils dreifache Bestimmung, Variationskoeffizienten < 4 Prozent

 

Mit steigender Reaktionstemperatur sinkt die gemessene Tannoidkonzentration, das Trübungsmaximum wird scheinbar schneller erreicht. Bei einer konstanten Temperatur von 25 °C ergaben sich für unterschiedliche Dosiergeschwindigkeiten die in Tabelle 2 dargestellten Werte. Bei schnellerem Zugeben von PVP-Lösung steigt die gemessene Tannoidkonzentration an.

 

Tabelle 2: Messergebnisse in Abhängigkeit der Dosiergeschwindigkeit

2,0 ml/h

30,02 mg/l

2,5 ml/h

31,72 mg/l

3,0 ml/h

34,03 mg/l

jeweils dreifache Bestimmung, Variationskoeffizienten < 4 Prozent

 

Die bereits früher beobachteten Veränderungen der Tannoidkonzentration bei sinkender Messtemperatur und steigender Dosiergeschwindigkeit konnten bei der Messung von Drogenextrakten bestätigt werden (9). Die ermittelten Unterschiede im Tannoidgehalt sind jedoch relativ gering. Um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten sollten die Parameter Temperatur und Dosiergeschwindigkeit also genau eingehalten werden.

Ein Vergleich der Tannometer-Werte mit den nach der Methode des Europäischen Arzneibuches ermittelten Gerbstoffwerten zeigt, dass beide Methoden miteinander korrelieren (Tabelle 3). Der Zusammenhang ist jedoch nicht streng linear. Diese Beobachtung leuchtet ein, da beide Methoden auf ganz unterschiedlichen Bestimmungsverfahren beruhen und dabei unterschiedliche chemische und strukturelle Eigenschaften der Verbindungen berücksichtigt werden.

 

Tabelle 3: Tannometer und Hautpulvermethode im Vergleich

Droge 
(Ph. Eur.)

Tannoidgehalt
(mg/l)

Gehalt in Prozent
(Hautpulvermethode Ph. Eur.)

Hamamelisblätter

32 

2.80

Gänsefingerkraut

20 

1,63

Tormentillwurzelstock

70 

9,00

Walnussblätter

29 

1,50

Eichenrinde

37 

5,00

Ratanhiawurzel

43 

4,80

 

Chromatographie überlegen aber aufwändiger

Die PVP-Trübungsmethode (Tannometer) bietet die Möglichkeit, ohne weitere Probenvorbereitung den Polyphenolgehalt gerbstoffhaltiger Drogenextrakte relativ schnell zu bestimmen. Das Verfahren lässt sich gut steuern und die Trübungskurven können mit Hilf kommerzieller Softwareprogramme einfach aufgezeichnet und ausgewertet werden. Mit der Trübungsmethode werden im Gegensatz zu den üblichen photometrischen Bestimmungen die adsorptiven Eigenschaften von Gerbstoffen an Makromoleküle bestimmt. Man erhält dabei nur Informationen über den Gesamtgehalt und keine Hinweise zur Zusammensetzung beziehungsweise chemischen Grundstruktur der Gerbstoffe. Chromatographische Methoden sind also nach wie vor überlegen, jedoch mit wesentlich größerem zeitlichen und apparativen Aufwand verbunden.

 

Literatur

  1. Treutter, D. , et al., Identification of flavan-3-ols and procyanidins by HPLC and chemical reaction detection. J. Chromatogr. A 667 (1994) 290 - 297.
  2. Hammerstone, J., F., et al., Identification of Procyanidins in Cocoa and Chocolate using HPLC/MS. J. Agric. Food Chem. 40 (1992) 490 - 496.
  3. Chapon, L., Monatsschrift für Brauwissenschaft 46 (1993) 263 - 279.
  4. Chapon, L., Monatsschrift für Brauwissenschaft 48 (1995) 300.
  5. Information Firma Pfeuffer: www.pfeuffer.com
  6. Chapon, L., Monatsschrift für Brauwissenschaft, 49 (1996) 12.
  7. Bedienungsanleitung Tannometer, Pfeuffer GmbH, D-97318 Kitzingen
  8. Ph. Eur., Nachtrag 2000, Methoden der Pharmakognosie 2.8.14
  9. Donhauser, S., Glas, K., Staatliche Brautechnische Prüf-und Versuchsanstalt, Freising-Weihenstephan, unveröffentlichte Untersuchungen.
  10. Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, Band 5, Drogen A-E. Hrsg: R. Hänsel, K. Keller, H. Rimpler, G. Schneider, Springer Verlag (1993) Berlin, Heidelberg, New York.
  11. Siebert, K. J., Effects of Protein-Polyphenol Interactions on Beverage Haze, Stabilization and Analysis; J. Agric. Food Chem. 47 (1999) 353 - 362.

 

Wir danken der Firma Pfeuffer in Kitzingen für die Überlassung des Tannometers.

 

Für die Verfasser:
Professor Dr. Gerhard Franz
Institut für Pharmazeutische Biologie
Universität Regensburg
Universitätsstraße 31
93040 Regensburg
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