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Strukturelle Massenspektrometrie: Im Hochempfindlichkeitsbereich

PHARMAZIE

 
Strukturelle Massenspektrometrie

Im Hochempfindlichkeitsbereich


Von Andrea Sinz, Halle / Welche Aminosäuresequenz hat der Antikörper? Wie ist das Protein gefaltet? Welcher Signaltransduktions-Weg läuft ab? Mithilfe hochmoderner Massenspektrometer geht die Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie und Bioanalytik am pharmazeutischen Institut der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg diesen Fragen auf den Grund.

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Die Methoden der strukturellen Massenspektrometrie erleben seit mehreren Jahren eine hohe Aufmerksamkeit, da sie eine Strukturuntersuchung von Proteinsystemen erlauben, die sich den klassischen Methoden der Protein­strukturanalyse, wie der Röntgen­strukturanalyse und der NMR-Spektro­skopie, entziehen. Bei den Pharmazeuten in Halle liegt der Schwerpunkt auf der Entwicklung proteinanalytischer und massenspektrometrischer Methoden zur Aufklärung von dreidimensionalen Proteinstrukturen und Protein-Protein-Wechselwirkungen mit dem Ziel, Signaltransduktionswege zu studieren. Die Untersuchung der Proteine erfolgt mithilfe der Massenspektrometrie, die eine Analyse geringster Proteinmengen im femto- bis attomol-Bereich (10-15 bis ­10-18 mol) erlaubt.




Massenspektrometer kann man mit einer hochempfindlichen Waage vergleichen: Würde man eine Million Ameisen auf einer solchen Waage platzieren und eine davon würde weglaufen – das Massenspektromer würde es bemerken.

Foto: iStock/witoon214


In der Abteilung sind mehrere hochmoderne Massenspektrometer vorhanden. Mittels einer Ionenquelle werden wenige Mikroliter der flüssigen Probe in die Gasphase überführt und anschließend analysiert. Die Methode zeichnet sich durch eine extrem hohe Genauigkeit aus. Ein weiterer Vorteil ist die sehr hohe Empfindlichkeit: Die Mole­küle eines im Bodensee aufgelösten Stück Zuckers könnten problemlos analysiert werden.

 

Am pharmazeutischen Institut in Halle werden vielfältige Proteinysteme studiert. Ein Schwerpunkt der Forschung liegt auf Calcium-bindenden Proteinen wie Calmodulin und die ­Guanylatzyklase-aktivierenden Proteine, die für Signaltransduktionsprozesse im menschlichen Körper essenziell sind. Guanylatzyklase-aktivierende Proteine sind zum Beispiel für den Sehprozess von Bedeutung. Auch Peroxisom-Pro­liferator-aktivierende Rezep­toren sind Gegenstand der massenspektrometrischen Untersuchungen. Diese stellen wichtige Angriffspunkte bei der Behandlung des metabolischen Syndroms dar. Zudem untersucht die Arbeitsgruppe seit Kurzem das Tumorsuppressorprotein p53, das auch als Wächter das Genoms bezeichnet wird.



Die Strukturanalyse von p53 stellt eine besondere Herausforderung dar, da es zu etwa 40 Prozent intrinsisch ungeordnet, also ungefaltet, vorliegt. Intrinsisch ungeordnete Proteine zeichnen sich dadurch aus, dass ihnen eine definierte oder geordnete drei­dimensionale Struktur fehlt. Durch die Bindung an andere Proteine können allerdings Strukturen ausgebildet werden. In den vergangenen Jahren wurde immer deutlicher, dass sie eine wichtige Rolle in regulatorischen Signaltransduktionswegen spielen, die für alle Vorgänge in der Zelle von Bedeutung sind.

 

Detaillierte Einblicke in Strukturen

 

Neue Untersuchungen an p53 mittels einer Kombination aus chemischer Quervernetzung und nativer Massenspektrometrie liefern nun detaillierte Einblicke in die Struktur des p53-Tetramers. Die Ergebnisse lassen auf eine hohe Flexibilität von p53 in der Abwesenheit von DNA schließen. Zudem scheint das p53-Tetramer eine kompaktere Struktur anzunehmen als es das momentan gängige Modell des p53-­Tetramers ausweist. Die Massen­spektrometrie stellt in diesem Fall eine ausgezeichnete Methode zur Strukturuntersuchung des p53 dar, die auch für andere intrinsisch ungeordnete Prote­ine eingesetzt werden kann.


Grundlagen der Massenspektrometrie

Die Methode der Massenspektrome­trie ist inzwischen mehr als hundert Jahre alt. Ihr Durchbruch als wichtige Analysenmethode in der organischen Chemie gelang ihr jedoch erst um 1960. Alle massenspektrometrische Analysatoren haben die Fähigkeit, ­Ionen entsprechend ihres Masse-zu-Ladungs-Verhältnisses (m/z) zu unterscheiden. Im Gegensatz zu anderen analytischen Methoden bestimmt man mit der Massenspektrometrie nicht nur die durch die chemische Struktur bedingten Eigenschaften eines Moleküls wie die Färbung oder Fluoreszenz, sondern das Molekül selbst. Voraussetzung für die massenspektrometrische Analyse ist eine Ionisier­barkeit der Moleküle. Erst seit Ende der 1980er-Jahre können durch die Entwicklung der schonenden Ioni­sierungstechniken Matrix-Assistierte ­Laser-Desorption/Ionisation (MALDI) und Elektrospray-Ionisation (ESI) auch große Biomoleküle wie Peptide und Proteine analysiert werden.

 


Die in der Abteilung entwickelten Methoden sind auch für die pharmazeutische Industrie von Bedeutung, um Proteinarzneistoffe zu charakterisieren. Das ist insofern von besonderem Interesse, da die Entwicklung von Protein-Arzneistoffen (vor allem Antikörper) immer mehr zunimmt. Die Massenspektrometrie erlaubt die Über­prüfung der hergestellten Proteine hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz, die Kontrolle von Abbauprodukten sowie die Analyse von Proteinmodifika­tionen.




Professor Dr. Andrea Sinz leitet die Abteilung Pharmazeutische Chemie und Bioanalytik der Martin-Luther- Universität Halle-Wittenberg.

Foto: Norbert Kaltwaßer


Ebenso kann die korrekte Faltung der Proteine mittels der Kombination aus chemischer Quervernetzung und Massenspektrometrie überprüft werden. Die Massenspektrometrie ist daher eine Technik, die in Zukunft in der pharmazeutischen Industrie immer weiter an Bedeutung gewinnen wird, da sie eine schnelle und zuverlässige Analyse von Proteinen in geringsten Mengen erlaubt.

 

Für Apotheken noch Zukunftsmusik

 

Ein Einzug der Massenspektrometrie in die Apotheke ist momentan für kleinere Massenspektrometer wie Quadrupol-Geräte denkbar, die eine rasche Bestimmung der Molekulargewichte von niedermolekularen Substanzen ­erlauben und so für die schnelle Identitätsbestimmung von Wirkstoffen ­einsetzbar sind. Die hohen Anschaffungskosten der Geräte beschränken momentan allerdings einen großflächigen Einsatz auf die pharmazeutische Industrie und Hochschulen. Es gibt ­jedoch Ansätze für die Entwicklung kleiner, tragbarer Miniatur-Massenspektrometer, die für den allgemeinen Gebrauch in der Apotheke und auch im täglichen Leben zur Kontrolle von ­Lebensmitteln im Supermarkt anwendbar sind. Es bleibt spannend, was die nächsten Jahre an interessanten ­Neuentwicklungen, sowohl methodisch als auch instrumentell, bringen werden. /


Dies ist der erste Teil einer Serie, in der die PZ herausragende pharmazeutische Forschung an deutschen Hochschulen vorstellt.

 



Beitrag erschienen in Ausgabe 26/2017

 

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