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Wettlauf mit resistenten Bakterien

TITEL

 
. Antibiotika

Wettlauf mit resistenten Bakterien

von Peter Heisig, Hamburg, und Ulrike Holzgrabe, Würzburg

Mit dem ersten Einsatz von Antibiotika bei Infektionen haben die Bakterien gezeigt, dass sie sich zu wehren verstehen. Vielfältige Mechanismen haben sie dazu entwickelt. Und wenn die Forscher aufhören, neue Antibiotika zu entwickeln, ist es nicht unwahrscheinlich, dass die Bakterien das Rennen zwischen Hase und Igel gewinnen.

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Auf der Naturforschertagung 1883 in Freiburg verkündete der Kasseler Arzt Moritz Alsberg kurz nach der Entdeckung der Erreger von Cholera und Tuberkulose durch Robert Koch:

»... Freunde, lasset mich Euch künden,
wie Bacillen, Mikrokokken,
Spirochaeten bald verschwinden....«

Der ersten Identifizierung von Bakterien als Infektionserreger entsprang eine allgemein euphorische Stimmung. Dieser Glaube an den medizinisch-pharmazeutischen Fortschritt in der Therapie von Infektionskrankheiten wurde später durch die ersten Erfolge beim Einsatz von Impfstoffen und Chemotherapeutika genährt. Letztendlich war es Paul Ehrlich, der nicht nur im

Bereich der Immunologie und Serumgewinnung (gemeinsam mit Emil von Behring) bahnbrechende Entwicklungen vollbrachte, sondern auch als Begründer der antimikrobiellen Chemotherapie angesehen werden muss, die er mit den Worten einleitete: »Wir müssen also zielen lernen, chemisch zielen lernen.«

Damit war die gezielte Entwicklung von Wirkstoffen, zunächst von Farbstoffen, mit Aktivität gegen infektiöse Mikroorganismen bei möglichst geringer Toxizität für den infizierten Wirt gemeint. Die bakterielle Fähigkeit zur schnellen Entwicklung von Resistenzen war noch nicht bekannt.

Was bedeutet Resistenz?

Der Begriff Resistenz umfasst einerseits die primäre oder natürliche Resistenz, die alle Vertreter einer bakteriellen Spezies betrifft, andererseits die sekundäre oder erworbene Resistenz, die sich lediglich bei einzelnen Stämmen einer ansonsten primär empfindlichen Spezies findet. So sind alle Stämme von Escherichia coli natürlicherweise, das heißt primär resistent gegen Penicillin G, während nur manche Stämme von Staphylococcus aureus eine erworbene, das heißt sekundäre Resistenz gegen dieses Antibiotikum aufweisen. Der Anteil sekundär resistenter Stämme kann zu verschiedenen Zeiten (saisonal) und an verschiedenen Orten (einzelne Krankenhäuser, in unterschiedlichen Ländern) stark variieren.

Die primäre Resistenz beruht oft auf besonderen Eigenschaften der bakteriellen Zellbestandteile wie einer undurchlässigen äußeren Membran oder einer im Aufbau leicht abgeänderten Zielstruktur. Dagegen liegen der erworbenen Resistenz genetische Veränderungen zu Grunde, die zu sehr unterschiedlichen Ausprägungen auf molekularbiologischer Ebene führen können. Weder durch Veränderung der ursprünglichen Struktur eines Wirkstoffs noch durch Einführung neuartiger Wirkstoffklassen ist es bislang gelungen, das Problem der Resistenzentwicklung dauerhaft in den Griff zu bekommen. Damit gleicht der Prozess der Antibiotika-Entwicklung dem Wettrennen zwischen Hase und Igel, wobei dem Menschen bislang immer die Rolle des Hasen zugefallen ist.

Eine detaillierte Kenntnis der molekularen Mechanismen ist eine wesentliche Voraussetzung, um mit einer gewissen Erfolgschance in ein neues Rennen zu gehen. Der Entwicklungsstopp neuer Antibiotika, wie er von manchen pharmazeutischen Herstellern erwogen und zum Teil bereits realisiert wurde, kann die ohnehin schwierige Situation in der Behandlung von Infektionskrankheiten weiter verschlechtern.

Erste Beobachtungen zum Resistenzphänomen fallen in die Zeit der Erfindung des Penicillins. Das seit 1943 verfügbare Penicillin G war zunächst sehr wirkungsvoll gegen Erkrankungen durch Staphylokokken und Streptokokken. Bereits ein Jahr später wurden die ersten resistenten Stämme von Staphylococcus aureus beschrieben, deren Anteil sich innerhalb von fünf Jahren verzehnfachte. 1961 kam mit Methicillin ein Derivat auf den Markt, das speziell gegen Penicillin-G-resistente Staphylokokken wirksam war. Doch innerhalb nur eines Jahres folgten erste Berichte über Methicillinresistenz bei Staphylokokken, so genannte MRSA (Methicillin-resistente Staphylococcus aureus). Diese Stämme sind resistent gegenüber allen β-Lactamantibiotika.

In jüngster Zeit weisen MRSA-Isolate zunehmend zusätzliche Resistenzen auf, zum Beispiel gegenüber Makrolidantibiotika, Fluorchinolonen, Tetracyclinen oder Aminoglykosiden, sodass bis vor kurzem lediglich Vancomycin als einzige Option blieb (1). Insbesondere in den USA wurde daher verstärkt Vancomycin gegen MRSA eingesetzt. Der vermehrte Selektionsdruck hat in den 90er-Jahren nicht nur zum Anstieg der Zahl Vancomycin-resistenter Enterokokken (VRE) geführt (2), sondern auch zur Entstehung Vancomycin-intermediär-resistenter Staphylococcus aureus-(VISA)-Isolate beigetragen (3). Mit der erstmaligen Isolierung eines gegen Vancomycin vollständig resistenten MRSA-Stamms im Jahre 2002 hat die Resistenzentwicklung eine neuartige Dimension bekommen.

Welche Faktoren tragen zu einer so raschen Entwicklung von bakterieller Resistenz gegenüber Antibiotika bei? Dank ihrer hohen genetischen Variabilität können Bakterien Informationen für Resistenzeigenschaften rasch in ihr Erbgut aufnehmen (Mutation und Transposition) und durch parasexuelle Prozesse wie Transformation, Transduktion und Konjugation sogar zwischen Vertretern nur entfernt verwandter Arten effektiv austauschen (4).

 

Glossar
  • ABC-Transporter: ATP-binding-casette-Transporter
  • erm-Gen: erythromycin ribosome methylase gene
  • ESBL: extended-spectrum β-lactamase
  • MDR: multidrug-resistance mdr-Effluxpumpe: multidrug-resistance-Protein, zum Beispiel TetA
  • mecA-Gen: Methicillin-Resistenzgen, das PBP-2A codiert
  • mefA-Gen: macrolide-specific efflux gene MFS-Transporter: major facilitator superfamily-Transporter
  • MHK: minimale Hemmkonzentration
  • MLS-Antibiotika: Makrolide, Lincosamide, Streptogramine
  • MRSA: Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus
  • NCCLS: National Committee on Clinical Laboratory Standards
  • PBP: Penicillin-Bindeproteine
  • QRDR: Quinolone-resistance-determining region
  • Scc: Staphylokokken-Chromosom-Casette
  • TetR: Tetracyclin-Repressor
  • VRE: Vancomycin-resistente Enterokokken

 

Eine weitere wichtige Rolle spielt die Umgebung, die über Stabilität und Wirksamkeit der bakteriellen Resistenzeigenschaften entscheidet. Neben der Fitness der resistenten Zellen bestimmt vor allem der Selektionsdruck, in welchem Umfang sich Resistenzgene etablieren und verbreiten können. Dabei geht der wesentliche Selektionsdruck vom Menschen durch einen unsachgemäßen Einsatz von Antibiotika aus, zum Beispiel durch zu geringe, zu kurze oder falsch indizierte Gabe. Hier sind auch Arzneimittelfälschungen zu nennen. Unseriöse Hersteller bringen Antibiotika, die entweder den deklarierten Arzneistoff gar nicht oder nur in zu geringen Mengen enthalten, in den Verkehr. Davon sind inzwischen nicht nur Dritte-Welt-Länder, sondern auf Grund der Globalisierung die gesamte Welt betroffen. Hier ist die analytische Kompetenz des Pharmazeuten als Arzneimittelfachmann besonders gefragt.

Sozioökonomische Faktoren wie verstärkte Reisetätigkeit, Langzeittherapie schwerkranker oder pflegebedürftiger Patienten sowie unzureichende Hygienepraktiken auch in Kliniken der Industrieländer tragen ebenfalls zu einer raschen Ausbreitung resistenter Erreger bei.

Wie Resistenz gemessen wird

Der Begriff Resistenz kann auf zwei Arten definiert werden, nämlich als biologische und als klinische Resistenz. Während man bei der biologischen Resistenz die relative Unempfindlichkeit eines Bakterienstamms in Bezug auf den Hauptanteil von Stämmen derselben Spezies betrachtet, berücksichtigt die klinische Resistenz, ob ein Stamm in Anwesenheit der therapeutisch erreichbaren Konzentration eines Antibiotikums am Infektionsort überleben kann (5).

Für die experimentelle quantitative Bestimmung der Resistenz stehen mehrere Verfahren zur Verfügung, für die national gültige Standardvorschriften existieren (DIN, CEN, NCCLS). Als Methode der Wahl sollte die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) mit Hilfe einer Reihenverdünnung des Antibiotikums erfolgen, entweder in flüssigem (Bouillondilution) oder festem Nährmedium (Agardilution). Zu den einzelnen Verdünnungen eines Antibiotikums wird jeweils eine definierte Menge an Bakterienzellen (Keimeinsaat oder Inokulum) gegeben und für eine bestimmte Zeit inkubiert. Die geringste Konzentration des Antibiotikums, die kein sichtbares Wachstum mehr erlaubt, ist die MHK. Ein untersuchter Keim wird anhand des ermittelten MHK-Werts im Vergleich zu vorgegebenen Grenzwerten von empfindlichen Keimen als resistent oder empfindlich eingestuft.

Daneben findet der Agardiffusionstest als weniger aufwendige und preiswertere, aber weniger exakte Methode weite Anwendung in der Routinediagnostik. Hierbei werden bis zu acht Filterpapierplättchen, die jeweils mit einem Antibiotikum in definierter Menge beladen sind, auf einen Nähragar aufgelegt, der mit dem zu testenden Keim gleichmäßig beimpft worden ist. Das Ergebnis erhält man in Form eines Hemmhofdurchmessers, dessen Größe mit dem Logarithmus der Konzentration des Antibiotikums korreliert. Über eine Korrelationsgerade lässt sich dann indirekt aus dem Hemmhofdurchmesser die MHK ableiten. Für den klinischen Bereich wird oft nur geprüft, ob der Hemmhofdurchmesser oberhalb oder unterhalb eines Referenzwerts liegt. Dementsprechend wird das Ergebnis als resistent, empfindlich oder intermediär angegeben.

Entscheidend für die Auswahl eines Antibiotikums zur Therapie ist die Interpretation des MHK-Werts, das heißt die Festlegung von Grenzwerten. Hierfür spielen neben dem experimentell ermittelten Ergebnis der Empfindlichkeitsprüfung auch die Art des Erregers, das klinische Bild und die pharmakokinetischen Eigenschaften des Antibiotikums eine wichtige Rolle.

Neuerdings werden bestimmte genetische Resistenzdeterminanten durch molekulargenetische Techniken wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nachgewiesen (6). Dazu zählen zum Beispiel das mecA-Gen, dessen Produkt die Resistenz von Staphylococcus aureus gegen Methicillin und alle übrigen β-Lactamantibiotika vermittelt, oder das vanA-Gen, dessen Produkt bei Enterokokken Glykopeptidresistenz verursacht.

Mechanismen bakterieller Resistenz

Prinzipiell lassen sich drei Mechanismen der bakteriellen Antibiotikaresistenz unterscheiden.

  • Veränderung der Zielstruktur des Antibiotikums: Neben genetischen Veränderungen wie Punktmutationen können auch enzymatische Modifikationen an der Zielstruktur die Bindungsstelle für ein Antibiotikum so verändern, dass die Affinität für das Antibiotikum reduziert wird.
  • Verminderte Konzentration des Wirkstoffs an der Zielstruktur: Dies kann auf zwei Wegen erreicht werden, entweder durch reduzierte Aufnahme des Wirkstoffs in die Bakterienzelle oder durch gesteigerten aktiven Auswärtstransport oder durch Kombination beider Mechanismen.
  • Enzymatische Inaktivierung des Antibiotikums: Derartige Reaktionen können außerhalb oder innerhalb der Bakterienzelle stattfinden und umfassen neben hydrolytischer Spaltung vor allem enzymatische Modifikationen durch Übertragung einer funktionellen Gruppe.

Alle bekannten Resistenzmechanismen lassen sich auf diese Grundmuster zurückführen, wobei die verschiedenen Spezies unterschiedliche Mechanismen bevorzugen (Tabelle). Während zu Beginn des Antibiotikazeitalters einzelne Mechanismen im Vordergrund standen, finden sich heute zunehmend Kombinationen. Die Bakterien zeigen entweder eine besonders hohe Resistenz selbst gegen neueste Vertreter einer Wirkstoffklasse oder eine breite Resistenz gegenüber vielen verschiedenen Wirkstoffgruppen (Multiresistenz).

 

Tabelle: Übersicht über die Verbreitung von Resistenzmechanismen bei unterschiedlichen Antibiotikaklassen

Antibiotikum Zielstruktur Permeabilität Inaktivierung vorwiegend resistente Bakterien Aminocumarine A B C Gram(-) Aminoglycoside B C A Anaerobier Ansamycine A B C Gram(-) β-Lactame A B A Gram(+): Zielstruktur; Gram(-): Inaktivierung Chinolone A B -- Gram(+) (ältere Chinolone) Chloramphenicol C B A Gram(+) und (-) Glycopeptide A B C Gram(-) Lincosamide A B C Gram(-) Makrolide A B C Gram(-) Streptogramine A B B Gram(-) Sulfonamide A B -- Gram(+) und (-) Tetracycline C A (þ) Gram(+) und (-) (spezifischer Efflux)

A: Hauptmechanismus; B: alternativer Mechanismus; C: seltener Mechanismus; --: nicht detektiert

 

Paradebeispiel β-Lactamresistenz

Wie alle natürlichen Antibiotika haben auch die β-Lactame bereits Jahrmillionen vor ihrem klinischen Einsatz einen Selektionsdruck auf Bakterien im Lebensraum der Produzentenzellen ausgeübt. Während dieses Zeitraums haben die Bakterien Gegenstrategien, im Fall der β-Lactamantibiotika die Bildung von inaktivierenden Enzymen (β-Lactamasen), entwickelt und die entsprechenden Gene nicht nur an ihre Nachkommen, sondern auch an Zellen anderer Spezies der gleichen Generation weitergegeben. Die β-Lactamasen müssen für eine wirksame Resistenzausprägung außerhalb der Zellwand vorliegen, um die dortigen Zielstrukturen der β-Lactame, die Zellwand aufbauenden Penicillin-Bindeproteine (PBP), abzuschirmen. Aus diesen PBPs haben sich die β-Lactamasen wahrscheinlich evolutionär entwickelt.

Mechanistisch lassen sich zwei Grundtypen von β-Lactamasen unterscheiden. Die kleinere Gruppe der Metalloenzyme weist auf Grund ihres katalytisch wichtigen Zinkions eine evolutionäre Verwandtschaft zu Proteasen wie der Carboxypeptidase A auf. Diese Enzyme kommen bei Stenotrophomonas-Arten vor, die mit Pseudomonaden verwandt sind, und vermitteln Resistenz auch gegen die ansonsten sehr stabilen und hoch wirksamen Carbapeneme (Imipenem, Meropenem).

Die meisten β-Lactamasen gehören jedoch dem Serinprotease-Typ an. Die korrespondierenden Gene kommen sowohl plasmidgebunden als auch chromosomal codiert vor. Neben der Penicillinase BlaZ von Staphylokokken, die bei den ersten β-Lactam-resistenten S.-aureus-Isolaten gefunden wurde, sowie kompliziert regulierten, chromosomal codierten Enzymen bei einigen gramnegativen Erregern spielen heute vor allem plasmidcodierte Enzyme die wichtigste Rolle für die klinische Resistenz. Der ständig steigende Selektionsdruck durch immer neue, aktivere Wirkstoffe hat in den letzten 20 Jahren aus drei Prototyp-Enzymgruppen über 200 neuartige Varianten hervorgebracht. Darunter finden sich vor allem Enzyme mit erweitertem Wirkungsspektrum (extended-spectrum β-lactamases, ESBL) sowie Varianten, die auch eine Resistenz gegen β-Lactamaseinhibitoren (inhibitor-resistent, IR) bewirken (7).

Die Effektivität der hydrolytischen Inaktivierung von β-Lactamen durch β-Lactamasen kann bei gramnegativen Bakterien, die über eine äußere Membran als wichtigste Permeabilitätsbarriere verfügen, durch einen zweiten Mechanismus gesteigert werden. Eine Verengung oder verringerte Bildung der so genannten Porinkanäle sowie die verstärkte Bildung von »multi-drug resistance«-(mdr)-Effluxpumpen kann die Konzentration der β-Lactame am Wirkort reduzieren.

Ursprünglich hatte man angenommen, dass diese Pumpen lediglich Substrate im Cytoplasma binden und von dort nach außen transportieren können. Damit wären sie für die β-Lactamresistenz ohne Bedeutung. Neueste Erkenntnisse haben jedoch gezeigt, dass einige Vertreter der insgesamt fünf Pumpentypen, so die aus drei Teilen bestehenden Pumpen vom RND-Typ, in der Lage sind, auch Substrate aus dem periplasmatischen Spalt, dem Raum zwischen Cytoplasmamembran und äußerer Membran bei gramnegativen Zellen, ähnlich wie ein »Staubsauger« aufzunehmen und direkt aus der Zelle zu entfernen (8).

Bei grampositiven Bakterien, die nur über die ­ innere ­ Cytoplasmamembran verfügen, ist der Effekt von β-Lactamasen wesentlich geringer, da diese wegen des Fehlens einer äußeren Membran rasch von der Zellwand wegdiffundieren. Viel effizienter ist ­ vor allem bei Staphylokokken und Pneumokokken ­ die Bildung resistenter PBPs. Wegen der für die Bakterienzelle essenziellen Bedeutung der PBPs und der Überlappung der Bindungsstellen für das eigentliche Substrat (Zellwandbaustein Disaccharidpentapeptid) beziehungsweise das Antibiotikum ist eine rasche Veränderung der Bindungsstelle durch Punktmutation nicht möglich, ohne die natürliche Funktion zu beeinträchtigen.

Bei den MRSA findet sich ein zusätzliches, gegen alle bekannten β-Lactamantibiotika resistentes neues PBP-2a, dessen Gen mecA auf einem zusätzlichen genetischen Element, der Staphylokokken-Chromosom-Cassette (scc) lokalisiert ist. Dieses PBP-2a ist in der Lage, die Funktionen der ursprünglichen PBPs von Staphylokokken zu ersetzen, wenn diese durch β-Lactamantibiotika gehemmt sind. Den Ursprung des scc-Elements vermutet man in anderen Staphylokokken-Spezies, aus denen es durch horizontalen Gentransfer in einige S.-aureus-Stämme gelangt ist. Es existieren daher in der Welt nur wenige epidemiologisch unterscheidbare MRSA-Stämme, die jedoch auf Grund des Selektionsdrucks lokal mit sehr hoher Prävalenz verbreitet sind (in Deutschland zurzeit sechs Varianten). Bei Streptococcus pneumoniae beruht die β-Lactamresistenz ebenfalls auf der Bildung neuartiger resistenter PBP-Varianten, den PBP-X-Enzymen. Die molekulargenetische Analyse der entsprechenden Gene sowie der homologen Gene anderer Streptokokken-Spezies hat ergeben, dass die für PBP-X-codierenden Gene sich aus Fragmenten von PBP-Genen verschiedener Streptokokken zusammensetzen, das heißt so genannte Mosaikgene darstellen.

Für dieses Phänomen ist die Fähigkeit der Pneumokokken zur Transformation, das heißt zur Aufnahme von DNA-Fragmenten, die freigesetzt werden, wenn Bakterien in der Umgebung absterben, verantwortlich. Teile dieser DNA können nach Aufnahme in die Zelle anstelle eigener DNA in das Chromosom integriert werden. Dieser Rekombinationsvorgang zusammen mit weiteren Punktmutationen führt zur raschen Ausbildung einer neuartigen PBP-X-Variante, die ähnlich dem mecA-Gen eine breite β-Lactamresistenz vermittelt.

Vielfältige Abwehr der Makrolide

Die Resistenz gegenüber Makroliden kann auf drei Mechanismen beruhen (Übersicht bei (9)).

  • Veränderung der ribosomalen Bindungsstelle, die aus Teilen der 23S-rRNA und ribosomalen Proteinen gebildet wird: Dies geschieht durch enzymatische Methylierung einer Adeninbase der 23S-rRNA sowie Mutationen an derselben Stelle oder durch Modifikation an einem der beiden hauptsächlich beteiligten Proteine L4 oder L22 (target-site-modification). Wegen der Überlappung der Bindungsstelle für Makrolide mit der von Lincosamiden und Streptograminen vom Typ B wird dieser Resistenzmechanismus auch als MLSB-Typ bezeichnet.
  • Mdr-Efflux mittels eines Transporters vom »ATP-binding-casette«-Typ (ABC): Die Produkte der Gene mefA, mefE und msrA wirken als Effluxpumpen und senken so die intrazelluläre Makrolidkonzentration. Einige Transporter vermitteln gleichzeitig den Efflux von Streptograminen. Daher wird dieser Mechanismus als MS-Typ bezeichnet.
  • Enzymatische Inaktivierung der Makrolide: Dies erfolgt durch Esterasen, die den Makrolidring hydrolytisch spalten, oder durch Übertragung eines Nukleotidrestes. Diese Modifikationen spielen eine untergeordnete Rolle für die klinische Resistenz.

Die Wirkung der Makrolide beruht auf der Hemmung des Elongationsschritts der Proteinbiosynthese. Dabei kann die neu synthetisierte Peptidkette durch Blockade des Translokationsschritts nicht durch einen Kanal nach außen transportiert werden. Dazu interagieren die Makrolide vor allem mit den Nukleotiden Adenin in Position 2058 und 2059 der Domäne V der 23S-rRNA. Wird Adenin-2058 an der N6-Position methyliert, kommt es zur Resistenz. Die neuen Ketolide binden zusätzlich stark an Adenin-752, sodass ihre Wirkung von der Methylierung an A2058 nicht so stark beeinflusst wird.

Die für die Methylierung verantwortlichen Methylase-Enzyme werden durch Plasmid- oder Transposon-übertragene erm-Gene (erythromycin ribosome methylase) kodiert, von denen bisher mehr als 40 Varianten beschrieben sind. Bei Staphylokokken kommen vor allem die Gene ermA und ermC und bei Pneumokokken und Enterokokken ermB vor. Die Expression der erm-Gene ist entweder konstitutiv oder durch Makrolide induzierbar.

Der häufige Gebrauch von Makroliden als Alternative zu Penicillinen in der Therapie von Atemwegsinfekten, die meist durch Pneumokokken ausgelöst werden, hat zu einem deutlichen Anstieg der Zahl makrolidresistenter Erreger geführt. Dabei ließen sich Hinweise auf die unzureichende Dosierung oder die Wahl des Makrolidantibiotikums als Ursache für die rasche Resistenzentwicklung finden.

 

Take-home-Message Bakterien entwickeln Resistenzmechanismen und geben diese schnell weiter, wenn sie heute mit Antibiotika konfrontiert werden. Diese Resistenzen entstehen vor allem bei der suboptimalen Therapie einer Infektion am Menschen, während ein Einsatz in der Tiermast, zumindest in der EU keine Bedeutung mehr hat. Antimikrobielle Pestizide können aber den gleichen Zweck bei Getreide- und Gemüseanbau erfüllen. Auch im Haushalt werden häufig antibiotisch wirksame Zusätze in Seifen, Lotionen, Spülmitteln und Plastikwaren verwendet. Bei einem deutlich sparsameren Einsatz von Antibiotika würden der Selektionsdruck und damit die Häufigkeit von resistenten Erregern abnehmen. Dies wurde kürzlich in einer Studie zur Resistenzentwicklung bei Streptococcus pyogenes gegenüber Makroliden in Finnland und Japan gezeigt. Der Rückgang im Verbrauch der Antibiotika führte zu einer deutlichen Abnahme der Makrolidresistenz.

 

Fluorchinolone und Punktmutationen

Mit Nalidixinsäure stand 1962 der erste Vertreter dieser rein synthetischen Antibiotika zur Behandlung von Harnwegsinfekten durch gramnegative Enterobakterien zur Verfügung. Wegen rascher Resistenzentwicklung und geringer Bioverfügbarkeit war der Wirkstoffgruppe anfangs kein großer Erfolg beschieden. Erst die Modifikation am Grundgerüst durch Einführung eines Fluorsubstituenten an C6 und eines gesättigten N-haltigen Heterocyclus an C7 erhöhte die Wirksamkeit der neuen Fluorchinolone deutlich.

Das anfängliche Argument, dass eine Resistenzentwicklung gegen diese Wirkstoffgruppe kaum möglich ist, da es sich um rein synthetische Verbindungen handelt, traf leider nicht zu. Zwar ist bis heute kein enzymatischer Inaktivierungsmechanismus bei Bakterien bekannt, doch konnte in vitro und dann an klinischen Isolaten gezeigt werden, dass zwei einander ergänzende Mechanismen zu einer in mehreren Mutationsschritten ablaufenden Resistenzentwicklung beitragen. Dabei handelt es sich einerseits um Mutationen, welche die Affinität der Zielstrukturen verringern, und andererseits um Mutationen, welche die Aktivität von mdr-Effluxpumpen steigern.

Als zweite Zielstruktur wurde neben der seit 1976 bekannten bakteriellen Typ-II-Topoisomerase (Gyrase) Mitte der 90er-Jahre ein weiteres Enzym dieses Typs, die Topoisomerase-IV, bei den meisten medizinisch relevanten Pathogenen identifiziert. Erst wenn beide Zielstrukturen auf Grund von mindestens jeweils einer Mutation unempfindlicher geworden sind, wirkt sich dies klinisch auf die Empfindlichkeit der Zelle gegenüber Fluorchinolonen aus. Die erhöhte Expression einer spezifischen Effluxpumpe steigert die Höhe der Resistenz, bewirkt aber für sich genommen nur einen geringen Anstieg der MHK.

Typ-II-Topoisomerasen besitzen essenzielle Funktionen im DNA-Stoffwechsel der Zelle. Daraus wird verständlich, dass nur einige wenige Mutationen in den Strukturgenen gyrA und gyrB für die beiden Untereinheiten A und B der Gyrase sowie von parC und parE für die homologen Untereinheiten der Topoisomerase-IV toleriert werden, ohne dass die Enzyme ihre Funktion verlieren. Diese Mutationen liegen in stark konservierten Bereichen, die sich in allen bislang untersuchten Typ-II-Topoisomerasen finden. Mit der weiteren Modifikation des Chinolon-Grundkörpers durch neue Substituenten an C7 und C8 konnten jedoch auch neuartige Mutationen an anderen Codons identifiziert werden.

Diese Daten zu Mutationen sowie einige biochemische Daten zu den Affinitäten und den In-vitro-Hemmkonzentrationen verschiedener Fluorchinolone liefern derzeit die einzigen Informationen zum molekularen Wirkungsmechanismus dieser Antibiotikagruppe, da der als eigentliche Zielstruktur fungierende Komplex aus DNA und Holoenzym bislang röntgenkristallographisch nicht dargestellt werden kann. Somit liegen auch keine Informationen für ein rationales Drug Design vor, um künftig möglicherweise die Resistenzentwicklung zu verzögern. Ein viel versprechender Ansatz könnte jedoch die Kombination mit Inhibitoren der mdr-Effluxpumpen darstellen, wodurch sich die Aktivität bekannter Fluorchinolone auf resistente Keime erhöhen ließe.

Tetracycline und Effluxpumpen

Die Tetracyclin-Resistenz beruht im Wesentlichen auf einem spezifischen Efflux-Mechanismus, der durch einen H+/Tetracyclin-Antiporter, zum Beispiel TetA (10), bewerkstelligt wird. Dieses Gen unterliegt einer induzierbaren Regulation: Ohne Tetracyclin bindet der Tetracyclin-Repressor (TetR) als Homodimer an zwei Operatorsequenzen, tetO1 und tetO2, und bildet so einen (TetR)2tetO-Komplex. Damit wird sowohl die Expression des Tetracyclin-Antiporters als auch des -Repressors gehemmt.

Wenn Tetracyclinmoleküle (Tc) in die Bakterienzelle diffundieren, bilden sie mit Mg2+-Ionen Chelatkomplexe (MgTc)+. Diese binden an freie TetR-Moleküle und verursachen durch Gleichgewichtsverschiebung eine verstärkte Abdissoziation gebundener TetR-Moleküle. Nach Bindung an den (MgTc)+-Komplex wird eine Konformationsänderung des (TetR)2 hervorgerufen, sodass das strukturell veränderte (TetR)2 nicht mehr auf das Operatorgen tetO passt. Es kommt zur Expression der tetR- und tetA-Gene. Damit wird der Antiporter TetA, eine aus 12 Transmembranbereichen gebildete Pumpe, synthetisiert und in die cytoplasmatische Membran eingelagert. Durch diese Pumpe wird der (MgTc)+-Komplex aus der Bakterienzelle transportiert. Das Bakterium ist damit resistent.

Neue Wege aus der Resistenzfalle

Resistenzen, die durch den Auswärtstransport eines Antibiotikums aus der Zelle entstehen, können umgangen werden, indem man die dafür verantwortlichen Effluxpumpen hemmt. Dies ist nicht ganz trivial, da Effluxpumpen häufig nicht sehr selektiv Substanzen aus Zellen heraustransportieren. Dennoch gibt es einige Beispiele dafür, dass durch Hemmung solcher Pumpen die Empfindlichkeit der Bakterien gegenüber Antibiotika wiederhergestellt werden kann. So ergibt die Substitution mit einem Cyclopentylthioether an Ring B der Tetracycline einen potenten Hemmstoff des H+/Tetracyclin-Antiporters. 5´-Methoxyhydnocarpin aus Berberis fremontii hemmt die Effluxpumpe, die beispielsweise Norfloxacin aus Bakterienzellen transportiert.

Viele Resistenzen sind auf Plasmiden in den Bakterien kodiert, zum Beispiel bei β-Lactamasen, wobei es das natürliche Phänomen der Unverträglichkeit von Plasmiden gibt, das heißt, dass bestimmte Plasmide nicht zusammen in einer Bakterienzelle koexistieren können. Die Inkompatibilität wird durch nicht translatierte RNA-Moleküle, so genannte RNA I (I: Inkompatibilität), vermittelt. Plasmide, welche die gleiche RNA I tragen, sind inkompatibel. Deshalb wird ein zweites Plasmid mit einem ähnlichen Replikationsmechanismus in der Zelle nicht mitrepliziert. Kürzlich wurde gefunden, dass ein nicht klinisch verwendetes Aminoglycosid (Apramycin) in der Lage ist, die Inkompatibilitätsdeterminante RNA I zu imitieren (11). Mit Apramycin inkubierte Bakterien, die entsprechende Plasmide enthielten, verloren eben diese Plasmide während der Inkubation über 250 Generationen. Im genannten Fall wurde ein Ampicillin-Resistenz tragendes Plasmid dauerhaft aus der Bakterienzelle entfernt.

Vancomycin hemmt die Bildung der Zellwand auf Grund der Bindung an den D-Ala-D-Ala-Anteil der Zellwandvorstufe Disaccharidpentapeptid, wodurch die Zellwand nicht mehr quervernetzt werden kann. Resistente Bakterien bilden eine alternative Ligase, die den terminalen D-Alanin-Rest beispielsweise durch einen D-Lactat-Baustein ersetzt: Vancomycin kann nicht mehr binden. Ein katalytisch aktives Prolin-Derivat ist in der Lage, den Resistenz-verursachenden D-Ala-D-Lac-Teil abzuspalten und die Vancomycin-Empfindlichkeit von Enterokokken wieder herzustellen (12).

Ausblick

Weltweit suchen nur noch einige Pharmafirmen nach neuen Antibiotika. So wundert es nicht, dass die Experten bei der 43. Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC) 2003 in Chicago und der World Conference on Dosing of Antiinfectives (WCDA) 2004 in Nürnberg warnten: »Die Antibiotika-Pipeline der Pharmazeutischen Industrie läuft trocken« (13). Dafür nennt die forschende Arzneimittelindustrie vor allem ökonomische Gründe:

  • Die Behandlungsdauer ist auf kurze Zeiträume (meist 7 bis 10 Tage) begrenzt.
  • Die rasche Resistenzentwicklung bedingt eine kurze Halbwertszeit auf dem Markt.
  • Selbst bei gut wirksamen Antibiotika reduzieren Generika nach Ablauf der Patentfrist die Einkommensmöglichkeiten.
  • Hohe Sicherheitsanforderungen lassen aussichtsreiche Kandidaten in den klinischen Prüfungen früh »sterben«.
  • Neue Antibiotika werden für die Therapie von Infektionen, die durch hoch resistente Keime hervorgerufen werden, reserviert, um die Resistenzentwicklung zu verlangsamen.

Alle diese Punkte führen zu einem ungünstigen Verhältnis von Kostenaufwand und Amortisation der Entwicklungskosten. Die Reihe der Argumente lässt sich fortsetzen, obgleich die Antibiotika wertmäßig den drittgrößten Markt im Arzneimittelsektor ausmachen.

Die in Deutschland eingeführten innovationsfeindlichen Festbetragsgruppen führen dazu, dass die Firmen selbst mit völlig neuen Antibiotika keine ausreichend hohen Einnahmen mehr erzielen können, um die Kosten der Arzneimittelentwicklung zu decken. Dagegen werden derzeit in den USA Anreizsysteme geschaffen, um die Entwicklung neuer Antibiotika zu stimulieren. So ist beispielsweise die Verlängerung der Patentlaufzeit von erfolgreichen Wirkstoffen ­ »Blockbustern« ­ geplant für Hersteller, die sich gleichzeitig an der Entwicklung von neuen Antiinfektiva beteiligen.

In Deutschland bleibt nur die Hoffnung, dass der kurzfristig angestrebte Einspareffekt durch Verzicht auf Neuentwicklung nicht durch höhere Kosten für in den USA entwickelte und nach Deutschland importierte Antiinfektiva aufgehoben wird. Wenn Bakterien das Rennen zwischen Hase und Igel gewinnen, würde dies eine Zunahme von Todesfällen durch längst besiegt geglaubte Infektionskrankheiten bedeuten.

 

Literatur

  1. Kresken, M., et al. (für die Studiengruppe), Resistenzsituation bei klinisch wichtigen Antibiotika in Deutschland und im mitteleuropäischen Raum. Bericht über die Ergebnisse einer multizentrischen Studie der Arbeitsgemeinschaft Empfindlichkeitsprüfungen und Resistenz der PEG für Chemotherapie e. V. aus dem Jahr 2001. Antiinfectives Intelligence, Bonn 2003.
  2. National Nosokomial Infections Surveillance System: National Nosokomial Infections Surveillance System Report, data summary from January 1992 to June 2002. Am. J. Infect. Control. 30 (2002) 458-475; Chemother. J. Beilage 16/2001.
  3. Kresken, M., Resistenzsituation bei grampositiven Infektionserregern gegenüber Telithromycin und Linezolid in Deutschland. PharmuZ 33, Nr. 1 (2004) 20-27.
  4. Hacker, J., Hentschel, U., Dobrindt, U., Prokaryotic Chromosomes and Disease. Science 301 (2003) 790-793.
  5. Witte, W., Klare, I., Antibiotikaresistenz bei bakteriellen Infektionserregern ­ mikrobiologisch-epidemiologische Aspekte. Bundesgesundheitsbl. Gesundheitsforsch. Gesundheitsschutz 42 (1999) 8-14.
  6. Geiss, H. K., Mack, D., Seifert, H., Identifizierung von speziellen Resistenzmechanismen und Interpretation von Ergebnissen der Antibiotika-Empfindlichkeitstestung bei grampositiven und gramnegativen Erregern. Chemother. J. 13 (2004) 1-16.
  7. Wiegand, I., Molekulare und biochemische Grundlagen der Beta-Lactam-Resistenz durch Betalactamasen. Chemother. J. 12 (2003) 151-164.
  8. Lomovskaya, O., Totrov, M., Vacuuming the periplasm. J. Bacteriology 187 (2005) 1879- 1883.
  9. Heisig, P., Wirkungs- und Resistenzmechanismen. PharmuZ 33, Nr. 1 (2004) 10- 19.
  10. Saenger, et al., Der Tetracyclin-Repressor ­ das Musterbeispiel für einen biologischen Schalter. Angew. Chem. 112 (2000) 2122- 2133.
  11. De, J., Hergenrother, P. J., Combating Drug-Resistant Bacteria: Small Molecule Mimics of Plasmid Incompatibility as Antiplasmid Compounds. J. Amer. Chem. Soc. 126 (2004) 15402-15404.
  12. Chiosis, G., Boneca, I. G., Selective Cleavage of D-Ala-D-Lac by Small Molecules: Re-Sensitizing Resistant Bacteria to Vancomycin. Science, 293 (2001) 1484-1487.
  13. Clarke, T., Drug companies snub antibiotics as pipeline threatens to run dry. Nature 42 (2003) 225.

 

Die Autoren

Ulrike Holzgrabe studierte Chemie und Pharmazie in Marburg und Kiel. Es folgten 1982 die Approbation, 1983 die Promotion und 1989 die Habilitation in Pharmazeutischer Chemie in Kiel. 1990 erhielt sie einen Ruf an die Universität Bonn, wo sie von 1997 bis 1999 als Prorektorin tätig war. 1999 erhielt sie den Lehrstuhl für Pharmazeutische Chemie in Würzburg. Seit 2000 ist Professor Holzgrabe Mitglied der Deutschen Arzneibuchkommission am BfArM, seit 2001 auch der Europäischen Arzneibuchkommission und seit 2002 Mitglied des Wissenschaftlichen Beirats des BfArM. Von 2000 bis Ende 2004 war sie Vizepräsidentin der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft, seit Januar 2005 steht sie der DPhG ­ als erste Frau ­ als Präsidentin vor. Ihre Arbeitsschwerpunkte sind neben der Arzneibuchanalytik die Entwicklung von opioidartigen Analgetika und von Liganden an Muscarinrezeptoren.

Peter Heisig studierte Pharmazie in Berlin, erhielt 1982 die Approbation und fertigte von 1983 bis 1987 seine Promotionsarbeit am Max-Planck-Institut für Molekulare Genetik in Berlin an. 1997 habilitierte er sich am Institut für Pharmazeutische Mikrobiologie in Bonn und erhielt die Venia legendi für Pharmazeutische Biologie und Mikrobiologie. Seit September 2000 ist er als C4-Professor am Institut für Pharmazeutische Biologie der Universität Hamburg tätig und steht dem dortigen Institut für Pharmazie seit 2004 als Direktor vor. Neben der Mitgliedschaft in zahlreichen Fachgesellschaften leitet Professor Heisig die Arbeitsgruppe „Molekulare Methoden der Resistenzbestimmung” der Paul-Ehrlich-Gesellschaft. Er leitet den Ausschuss für Mikrobiologie beim BfArM und ist Mitglied der Arbeitsgruppe „Gentechnologisch hergestellte Arzneimittel” der Deutschen Arzneibuchkommission.

 

Anschriften der Verfasser:
Professor Dr. Ulrike Holzgrabe
Institut für Pharmazie und Lebensmittelchemie
Am Hubland
97074 Würzburg
holzgrabe@pharmazie.uni-wuerzburg.de

Professor Dr. Peter Heisig
Institut für Pharmazie
Department Pharmazeutische Biologie und Mikrobiologie
Bundesstraße 45
20146 Hamburg
heisig@chemie.uni-hamburg.de
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E-Mail: redaktion@govi.de


Beitrag erschienen in Ausgabe 25/2005

 

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