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Formelfest bei freien Radikalen und Fapy-Basen

02.11.1998
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-Pharmazie

Govi-Verlag

Formelfest bei freien Radikalen
und Fapy-Basen

Mit Bezug auf die Publikation einer englischen Arbeitsgruppe in der Zeitschrift Nature, die über prooxidative Eigenschaften von Vitamin C berichtete (1), war in dem PZ-Beitrag "Kein Krebsrisiko durch hohe Dosen Vitamin C" folgende Aussage zu lesen (2): "... hohe Dosen Vitamin C führten zur Bildung des freien Radikals 8-Oxoadenin und somit zu einer erhöhten Krebsgefahr".

Definitionsgemäß sind freie Radikale reaktionsfreudige Spezies mit einzelnen, ungepaarten Elektronen (3). Dies trifft für 8-Oxoadenin nicht zu, und diese modifizierte DNA-Base ist demnach auch kein freies Radikal. Freie Radikale sind allerdings an der Bildung von 8-Oxoadenin beteiligt. Insbesondere das Hydroxylradikal (4) reagiert infolge seiner Elektrophilie vorwiegend mit den elektronenreichen Purinbasen, weniger hingegen mit den elektronenärmeren Pyrimidinbasen.

Modifizierte Basen

Durch Angriff des Hydroxylradikals (•OH) am C-8 des Adenins entsteht als Primäraddukt das 8-Hydroxyadenin-Radikal (siehe Formelschema), welchem die folgenden Reaktionswege offenstehen (5, 6):

(a) Oxidation und Deprotonierung führen zum 8-Oxoadenin,

(b) Ringöffnung, anschließende Reduktion und Protonierung führen zu 4,6-Diamino-5-formamidopyrimidin (Fapy-Adenin), und

(c) Reduktion und Protonierung führen zu 7,8-Dihydro-8-hydroxyadenin, das als Hemiorthoamid zur Fapy-Base öffnet.

Formal gesehen sind die sogenannten Fapy-Basen Hydrolyseprodukte der Purinbasen. Wird 7,8-Dihydro-8-hydroxyadenin zu Adenin dehydratisiert, handelt es sich um einen Repair-Mechanismus.

Analog werden aus Guanin durch Angriff vom Hydroxylradikal 8-Oxoguanin und 2,4-Diamino-6-hydroxy-5-formamidopyrimidin (Fapy-Guanin) gebildet (5,6). 8-Oxoguanin beziehungsweise das 8-Hydroxytautomer gelten als eigentliche Biomarker für oxidativen Stress. Diese modifizierten DNA-Basen führen zu falscher Basenpaarung und Punktmutationen (7). Podmore und seine Kollegen (1) stellten allerdings fest, daß der Gehalt von 8-Oxoguanin in der Lymphozyten-DNA der Probanden unter Vitamin-C-Gabe signifikant abfiel.

Das primär gebildete 8-Hydroxyadenin-Radikal kann also oxidiert sowie reduziert werden, die kompetitiven Reaktionswege (a) und (c) dokumentieren dieses redox-ambivalente Verhalten. Oxidationsmittel vermindern die Bildung von Fapy-Basen und erhöhen statt dessen den Anteil an 8-Oxoadenin. Für Reaktionsweg (c) ist die Anwesenheit von Reduktionsäquivalenten erforderlich (5).

Was können wir daraus in bezug auf die Studie von Podmore et al. (1) ableiten? Vitamin C ist prinzipiell ein Reduktionsmittel, sollte demnach zur Bildung von Fapy-Basen beitragen. Hier bleibt offen, warum die Autoren keine Angaben zum Gehalt der Fapy-Basen machen. Er hätte mit Hilfe der in der Studie eingesetzten Gaschromatographie- und Massenspektroskopie-Technik (GC/MS) ohne weiteres bestimmt werden können. Die alleinige Angabe des Gehalts an Oxobasen als quantitatives Maß für eine mögliche DNA-Basen-Schädigung durch Prooxidantien gebietet Vorsicht in der Interpretation der Daten. Unterschiedliche Werte für den Gehalt an Oxobasen reflektieren nicht notwendigerweise den Angriff unterschiedlicher Mengen Hydroxylradikale an die DNA. So begünstigen Kupferionen und Wasserstoffperoxid die Bildung von Oxobasen gegenüber Fapy-Basen, während Eisenionen-abhängige Systeme substantiell beide Basenprodukte erzeugen (6, 8).

Die GC-MS-Technik ist unbestritten eine hochempfindliche und selektive Methode, insbesondere durch die Wahl des sogenannten SIM-Modus (selected ion monitoring), da unter diesen Bedingungen nur einzelne charakteristische Ionen innerhalb programmierter Zeitfenster beobachtet werden. Es darf aber nicht verschwiegen werden, daß mit der GC-MS-Methode der wahre Gehalt an oxidierten Basen überbewerten kann (8), bedingt durch Artefakte, die durch Hydrolyse- und Derivatisierungprozesse entstehen können. Eine ebenfalls hochempfindliche Bestimmungsmethode für Oxobasen ist die HPLC-Analyse mit elektrochemischer Detektion, die allerdings den wahren Gehalt unterbewerten kann, da die Quantifizierung der oxidierten Basen vor der eigentlichen HPLC-EC-Bestimmung eine Extraktion und vollständige enzymatische Hydrolyse erfordert (8). Eine ausgewogene Darstellung der Effizienz dieser Techniken hätte dem Beitrag sicher gut getan. So wird von den Autoren zwar die eigentliche Stärke der GC-MS-Methode - gleichzeitige Bestimmung von mehreren modifizierten Basen - beschrieben, aber nicht genutzt. Die Fapy-Basen wurden wie gesagt nicht bestimmt.

Fenton-Reaktion und Vitamin C

Wünschenswert wäre auch eine ausgewogene Darstellung möglicher Konsequenzen der 8-Oxoadenin-Bildung, indem entsprechende Repair-Mechanismen einbezogen werden (9). Schließlich bleibt anzumerken, daß Vitamin C eine bekannte Elektronenquelle zur Aufrechterhaltung Hydroxylradikal-produzierender Fenton-Systeme darstellt (10):

Vitamin C kann durch Reduktion von Fe(III) das für die Fenton-Reaktion benötigte Fe(II) zur Verfügung stellen und damit als Co-Prooxidans fungieren. Weitere kritische Hinweise zur Vitamin-C-Studie (1) sind den PZ-Beiträgen von Gunther Metz (11) und Christiane Berg (2) zu entnehmen.

Take-home-messages

Die Zeitschrift Nature ist ein sogenanntes High-Impact-Journal und mit einem Impact-Faktor von 27,07 Spitzenreiter der Journal-Hitparaden (12), wenn man von einigen wenigen Review-Zeitschriften absieht. Sind wir doch mal ehrlich, hätte da eine Publikation in einem Journal of Biological Chemistry mit einem Faktor von 7,39 nicht ausgereicht? Doktoranden, aufgepaßt! Es soll ja Universitäten geben, die das Prädikat für Dissertationen am Impact-Faktor des Publikationsorgans ausrichten. Für eine Dissertation mit dem Prädikat "summa cum laude" hätte es auf alle Fälle gereicht. Und immer noch besser, als eine Publikation in einer dieser Zeitschriften wie Journal of Organic Chemistry oder Journal of Medicinal Chemistry mit Faktoren von 3,25 oder 4,15, ganz zu schweigen von Liebigs Annalen (seit 1998 Eur. J. Org. Chem.), der Pharmazie oder dem guten alten Archiv der Pharmazie mit Faktoren von 1,3, 0,47 beziehungsweise 0,66, die für die Beurteilung einer Doktorarbeit lediglich ein schlappes "cum laude" hergeben. Vorsicht bei der Interpretation von Daten! Wie kann man da Abhilfe schaffen? Angeblich soll "unsere Ausbildung" (Pharmaziestudium) nur "formelfeste Chemieköche" hervorbringen, wie wir durch die Glosse von Lutz Bäucker (13) aufgeklärt wurden. Diese sind allerdings gegenüber "oxidativen Angriffen" formelfest gewappnet! Einfach eine Katastrophe, Herr B.? Die Fenton-Reaktion wird zum Beispiel vom Pharm Eur 97 zum Nachweis von Tartrat genutzt und entsprechend im ersten Semester des Pharmaziestudiums vermittelt. Auch das noch, war sie doch vielen schon immer ein Dorn im Auge. Aber sie ist ein Beispiel für die vielen grundlegenden Reaktionen aus der Chemie, die physiologische Relevanz aufweisen. Zum Verständnis physiologisch-chemischer Zusammenhänge sind daher die Kenntnisse entsprechender Formeln essentiell. "Formelfeste Chemieköche" bilden eine solide Basis für "formulierungssichere Ratgeber" ohne "Black-Box"-Pharmakologie-Verständnis.

PZ-Artikel von Klaus Müller, Münster

Anmerkung der Redaktion

Die Publikation von Ian Podmore und seinen Kollegen im Wissenschaftsmagazin Nature, die wir in PZ 17/98 auf Seite 62 für Sie zusammenfaßten, hat eine hitzige Debatte ausgelöst, ob ein zuviel an Vitamin C das Krebsrisiko steigert oder nicht. Vor allem Professor Dr. Rudolf Fahrig vom Fraunhofer Institut für Toxikologie und Aerosolforschung in Hannover äußerte Bedenken an Podomres Interpretation der Daten und dem Studiendesign (PZ 37/98 auf Seite 40). Professor Dr. Klaus Müller, Pharmazeutischer Chemiker an der Universität Münster kommentiert in seinem Beitrag den aktuellen Stand der Dinge.

Literatur

(1) Podmore, I. D., et al., Vitamin C exhibits pro-oxidant properties. Nature 392 (1998) 559-559.
(2) Berg, C., Kein Krebsrisiko durch hohe Dosen Vitamin C. Pharm. Ztg. 143 (1998) 3120.
(3) Pryor, W. A., The role of free radical reactions in biological systems. In: Pryor, W.A. (Hrsg.), Free Radicals in Biology, Vol. I, Academic Press, New York 1976, S. 1-49.
(4) Pryor, W. A., Why is the hydroxyl radical the only radical that commonly adds to DNA?... Free Radic. Biol. Med. 4 (1988) 219-223.
(5) Steenken, S. , Purine bases, nucleosides, and nucleotides: aqueous solution redox chemistry and transformation reactions of their radical cations and e- and OH adducts. Chem. Rev. 89 (1989) 503-520.
(6) Halliwell, B., Aruoma, O. I., DNA damage by oxygen-derived species. Its mechanism and measurement in mammalian systems. FEBS Lett. 281 (1991) 9-19.
(7) Richter, C. , Reactive oxygen and DNA damage in mitochondria. Mutat. Res. 275 1992) 249-255.
(8) Halliwell, B., Dizdaroglu, M., The measurement of oxidative damage to DNA by HPLC and GC/MS techniques. Free Radical Res. Commun. 16 (1992) 75-87.
(9) Demple, B., Harrison, L., Repair of oxidative damage to DNA: enzymology and biology. Annu. Rev. Biochem. 63 (1994) 915-948.
(10) Imlay, J.A., Linn, S., DNA damage and oxygen radical toxicity. Science 240 (1988) 1302-1309.
(11) Metz, G., Vitamin C in Prävention und Therapie: Wieviel, für wen, wozu? Pharm. Ztg. 143 (1998) 2773-2782.
(12) Journal Citation Reports (1995), Institute for Scientific Information.
(13) Bäucker, L., Ratlose Berater. Dtsch. Apoth. Ztg. 138 (1998) 2694.

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