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Biochemische Grundlagen des Membrantransportes

15.02.1999
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-TitelGovi-Verlag

TRANSPORTPROTEINE

Biochemische Grundlagen des Membrantransportes

von Peter Nuhn, Halle

Die biologische Membran trennt als Plasmamembran das Zellinnnere von der Umwelt und sichert damit die Integrität der Zelle. Innerhalb der Zelle führen Membranen zu einer Kompartimentierung (endoplasmatisches Retikulum, Kernmembran) und damit zur Einrichtung eigenständiger "Reaktionsräume" (Barrierefunktion der Membran).

Bei einer Zelle handelt es sich aber um ein System, das weit entfernt vom thermodynamischen Gleichgewicht ist oder - mit anderen Worten - das von der Umgebung, zum Beispiel Nachbarzellen und Umwelt, abhängig ist. Die essentielle Barrierefunktion der biologischen Membran muß deshalb auch selektive Transportprozesse und einen Informationsaustausch, der mit einer Signaltransduktion verbunden ist, mit anderen Zellen des Organismus ermöglichen. Es ist deshalb nicht weiter verwunderlich, daß die biologischen Membranen für die Pharmakokinetik und Pharmakodynamik von Arzneistoffen ganz wesentlich sind.

Die Membranen der Säugetierzellen werden im allgemeinen aus einer Lipidmatrix gebildet, in die Proteine ein- und angelagert sind. Die Lipidmatrix wird vor allem aus einer Phospholipiddoppelschicht (Bilayer) gebildet, in die Cholesterol zur Verfestigung inkorporiert ist. Das Lipid/Cholesterol-Verhältnis beträgt etwa 1 zu 1. Diese Bilayer liegt im fluiden Zustand als flüssig-kristalline Struktur vor. Das Gesamtlipid/Protein-Verhältnis schwankt stark und liegt bei durchschnittlich 2,3. In Bezug auf ihre Verankerung in der Membran werden periphere (extrinsic) und integrale (intrinsic) Proteine unterschieden. Periphere Proteine sind nur lose an die Membran gebunden und können unter relativ milden Bedingungen, zum Beispiel durch Veränderung der Ionenstärke, abgelöst werden. Integrale Proteine durchdringen die Membran und können nur unter drastischen Bedingungen, die zur Zerstörung der Membran führen (organische Lösungsmittel, Detergentien), aus dem Verbund isoliert werden.

Ein pharmakodynamischer Effekt setzt primär eine spezifische und hochaffine Wechselwirkung des Arzneistoffes mit einem molekularen Reaktionspartner im Organismus voraus. Bis auf einige Wirkstoffe, die an Nucleinsäuren (Mutagene, Zytostatika) oder den Lipidkomponenten der Membranen angreifen, handelt es sich bei diesen molekularen Wechselwirkungspartnern um Proteine. Nach ihrer Funktion lassen sich die Targetproteine im wesentlichen in drei Gruppen einteilen:

  • Enzyme,
  • Hormon- und Neurotransmitter-Rezeptoren sowie
  • Transportproteine.

Die Gruppen überlappen sich gegenseitig, da zum Beispiel Transportproteine Enzymaktivität aufweisen (ATPasen) oder Hormonrezeptoren an Enzyme, zum Beispiel an Adenylatcyclase, gekoppelt sind oder selbst Transporteigenschaften besitzen (ionotrope Neurotransmitter-Rezeptoren). Im Rahmen dieses Artikels soll nur auf Transportproteine als Targetstrukturen von Arzneistoffen oder allgemeinen Wirkstoffen eingegangen werden.

Passiver und aktiver Membrantransport

Beim Transport von anorganischen Kationen und Anionen oder Substanzen (geladen, ungeladen; lipophil, hydrophil) durch biologische Membranen werden zwei Typen unterschieden:

  • Der passive Transport erfolgt in Richtung eines Konzentrationsgradienten. Er kann einfach durch Diffusion lipophiler Substanzen durch die Lipidbilayer, aber auch durch Poren oder erleichtert durch Carrier vermittelt erfolgen. Solche mobilen Carrier werden zum Beispiel von Valinomycin gebildet, dürften aber als native Transportsysteme der biologischen Membran keine große Rolle spielen.
  • Der aktive Transport erfolgt entgegen dem Gradienten. Er erfordert Energie, die durch Hydrolyse von ATP, vermittelt durch die ATPase-Aktivität der Transportproteine und Ionenpumpen, geliefert werden kann.

Primäre aktive Transportprozesse durch ATPasen können an Systeme des erleichterten Transportes gekoppelt sein (sekundärer aktiver Transport). So kann zum Beispiel das durch die Na-Pumpe entstandene elektrochemische Potential für gekoppelte Transportprozesse genutzt werden. Der gekoppelte Transport zweier Substanzen wird als Cotransport bezeichnet; sofern er in die gleiche Richtung geht, spricht man von Symport, bei entgegengesetzten Richtungen von Antiport.

Die Membran ist verantwortlich dafür, daß Ionen (von Bedeutung sind vor allem Na+, K+, Ca2+, Mg2+ und Cl-) asymmetrisch zwischen der Zelle und der extrazellulären Umgebung verteilt sind. Während die Na- und Ca-Konzentration in der Zelle wesentlich niedriger ist, ist K+ in der Zelle selektiv konzentriert. Das spielt für die Aufrechterhaltung des Membranpotentials eine entscheidende Rolle. Die Selektivität der Ionenkanäle wird einerseits durch die Größe der Ionen und zum anderen durch die Größe und die Bindungsstellen der Kanäle auf der anderen Seite bestimmt. Die sehr niedrigen Konzentrationen an Na+ und Ca2+ werden durch aktives Herauspumpen durch ATPasen aufrechterhalten. Die Na+/K+-ATPase wird daher auch als Na-Pumpe, die Ca2+/Mg2+-ATPase als Ca-Pumpe bezeichnet. In beiden Fällen handelt es sich um Antiporter.

Die Innenseite der Zellmembran ist gegenüber der extrazellulären Seite negativer geladen. Die Potentialdifferenz beträgt bei Herzmuskelzellen 70 bis 90 mV. Die sich bei einer Erregung der Zelle abspielenden elektrochemischen Prozesse sollen am Beispiel einer Herzmuskelzelle dargestellt werden. Durch die Erregung strömt Na+ (Öffnung "schneller" Na-Kanäle für 0,5 ms) in die Zelle. Dadurch erhöht sich das Potential von -70 mV auf etwa +25 mV (Depolarisation). Durch nachfolgenden Einstrom von Cl- und Öffnung der "langsamen" Ca-Kanäle (50 ms) fällt das Membranpotential um etwa 20 mV. In der nächsten Phase werden K-Kanäle, insbesondere der Delayed-rectifier-Kanal (Ik-Kanal) geöffnet. Es strömt K+ aus der Zelle (Repolarisation). Bei etwa -80 bis -90 mV werden die K-Kanäle inaktiviert (Ruhepotential). In der diastolischen Phase wird über andere K-Kanäle (pacemaker current) der Ausgangswert wieder erreicht.

Antiarrhythmische Effekte können somit erreicht werden durch Blockade

  • der Spannungs-abhängigen Na-Kanäle (Antiarrhythmika Klasse I),
  • der Ca-Kanäle vom L-Typ (Antiarrhythmika Klasse IV: Calciumkanal-Antagonisten) oder
  • der K-Kanäle (Antiarrhythmika Klasse III).

Steuerung der Kanäle

Die Öffnung (gated) der Kanäle wird durch elektrophysiologische und chemische Faktoren reguliert. Die Kanäle für den erleichterten Transport werden daher differenziert in Spannungs-abhängige (voltage-gated channels) und Liganden-abhängige Kanäle (agonist-gated channels). Die Liganden-abhängigen Kanäle werden durch zahlreiche Neurotransmitter wie Acetylcholin, 5-Hydroxytryptamin (5-HT, Serotonin), die exzitatorischen Aminosäuren Asparagin- und Glutaminsäure (Asp, Glu), g-Aminobuttersäure (GABA) oder Glycin (Gly) kontrolliert. Zur Gruppe der ionotropen Neurotransmitter-Rezeptoren gehören der nicotinerge Acetylcholin-Rezeptor, der 5-HT3-Rezeptor, die Rezeptoren der exzitatorischen Aminosäuren, der GABAA- und der Glycin-Rezeptor.

Als Ionenkanal-regulierender Ligand wirkt auch ATP. Durch extrazelluläres ATP aktivierte Ionenkanäle kommen in Muskelzellen und Neuronen vor und werden zum Beispiel indirekt über die muscarinergen Acetylcholin-Rezeptoren geöffnet. Diese ATP-aktivierten Kanäle sind pharmakologisch sehr interessant, daran angreifende Arzneistoffe gibt es jedoch noch nicht (1). Die ATP-abhängigen K-Kanäle (KATP-Kanäle) werden durch die intrazelluläre ATP-Konzentration reguliert.

Die GABAA- und Glycin-Rezeptoren regulieren den Einfluß kleiner Anionen (Chloridkanal), die anderen Liganden den Einlaß kleiner Kationen (Na+, K+, Ca2+). Die Öffnung der Poren erfolgt innerhalb von Mikrosekunden. Die schnelle Reaktion ist möglich, da Agonist-Bindungsstelle und Ionen-permeierende Poren Teil desselben Proteinkomplexes sind.

In Zusammenhang mit Arzneistoffentwicklung und Wirkungsmechanismus sind einige Cotransporter von besonderem Interesse:

  • der Na+/Ca2+-Austauscher, ein Antiporter, der indirekt durch Hemmung der Na-Pumpe durch die inotropen Steroide aktiviert wird;
  • der Na+/H+-Austauscher, ebenfalls ein Antiporter;
  • der Na+/K+/2Cl--Cotransporter; o der Na+/I--Cotransporter sowie die große Gruppe der
  • Na-abhängigen Neurotransmitter-Transporter.

Aufgrund der Funktion der biologischen Membran als Barriere und Signalüberträger ist es nicht verwunderlich, daß zahlreiche Arzneistoffe ihre Wirkung durch Beeinflussung von Transportprozessen entfalten.

Charakterisierung der Transportproteine

Transportproteine für den erleichterten und aktiven Transport sind integrale, also die Membran durchspannende Proteine. Mit der Entwicklung der Techniken zur DNA-Klonierung und -Sequenzierung sind integrale Membranproteine in den letzten Jahren auch für differenzierte Strukturuntersuchungen zugänglich geworden. Etwa seit 1985 wurden unzählige Primärstrukturen veröffentlicht. Obwohl es bisher nahezu keine Röntgenstrukturuntersuchungen von integralen Membranproteinen gibt, sind dennoch einige bedeutende strukturelle Aussagen möglich. Nach der Art der Membrandurchdringung werden die integralen Membranproteine in sechs Typen eingeteilt, die sich hinsichtlich der Lokalisation des Amino- (N) und Carboxyl-Terminus (C) des Polypeptidkette (intra- oder extrazellulär) und der Anzahl der membrandurchdringenden Segmente unterscheiden.

Der die Membran durchspannende Teil der Polypeptidkette (span, S) ist a-helikal angeordnet. Diese Transmembransegmente bestehen aus einer Peptidsequenz von etwa 20 hydrophoben Aminosäuren (je 10 Prozent und mehr Leu, Ile, Ala, Phe, Val). Nach der Anzahl der Transmembransegmente werden Single Span-(Bitopic, Simple)-Membranproteine (Typ I und II) sowie Multiple Span-(Polytopic, Complex)-Membranproteine (Typen III bis VI) mit zwei bis wahrscheinlich 24 membrandurchdringenden Abschnitten unterschieden. Die Typen III und IV durchspannen die Membran geradzahlig, die Typen V und VI ungeradzahlig. Die Transmembransegmente sind durch hydrophile Peptidsequenzen (loops) verbunden, die in unterschiedlichen Sekundärstrukturen vorliegen können. Die Transportproteine gehören zu den Multispan-Membranproteinen. Ionotrope Neurotransmitter-Rezeptoren enthalten vier, Neurotransmitter-Transporter zwölf, Spannungs-abhängige Kationen-Kanäle viermal sechs Transmembransegmente.

Zu den Membranproteinen mit sieben membrandurchspannenden Helices gehören außer dem Sehpigment Rhodopsin auch zahlreiche Hormonrezeptoren, die an G-Proteine gekoppelt sind, zum Beispiel der muscarinartige Acetylcholin-Rezeptor, ß2-Adrenoceptor, A1-Adenosin-, D2-Dopamin-, Opiat- und Serotonin-Rezeptoren.

Die Transmembransegmente können sich in der Membran in unterschiedlicher Weise anordnen. Transportproteine mit hydrophilen Poren oder Kanälen können sich zu Poren (barrel) anordnen, bei denen die Helices amphiphil sind mit einer hydrophilen und einer hydrophoben, also mit den Lipiden in Wechselwirkung tretenden Seite der Helix.

Aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit, das heißt ihrer weitgehenden Homologie, sowie der Anzahl und Verteilung der Transmembransegmente lassen sich die Transportproteine zu einigen Superfamilien zusammenfassen:

  • Die ionotropen Neurotransmitter-Rezeptoren sind Pentamere, deren fünf Untereinheiten mit jeweils vier Transmembransegmenten (S1-S4) eine Pore bilden. Unmittelbar an der Pore ist S2 lokalisiert.
  • Die Spannungs-abhängigen Kationenkanäle (Na-, K-, Ca-Kanäle) bilden eine Pore aus einer sehr großen Polypeptidkette von etwa 2000 Aminosäuren, die aus vier sich wiederholenden (repeats) Domänen mit jeweils sechs Transmembransegmenten gebildet wird. Die repeats enthalten etwa 300 Aminosäuren und sind durch loops verbunden.
  • Die Neurotransmitter-Transporter bestehen aus einer Polypeptidkette aus etwa 600 bis 700 Aminosäuren mit insgesamt zwölf Transmembransegmenten (Typ IV). Zwischen den Transmembransegmenten S3 und S4 liegt ein längerer extrazellulärer loop mit mehreren Glykosidierungsstellen. Noch ist unklar, ob die physiologischen Transporter als Monomere oder Oligomere vorliegen.

Bei den ABC-Transportern (ABC-Proteine, ATP-bindende Kassetten-Proteine, ATP-binding cassette proteins) (3,4) und anderen Membranproteinen sind jeweils sechs Transmembransegmente zu Bündeln (Kassetten) zusammengefaßt, die über Polypeptidschleifen kovalent oder auch durch Ionenbeziehungen miteinander verbunden sind. Die ABC-Transporter der Prokaryoten enthalten vier Untereinheiten, davon zwei als integrale Proteine und zwei als periphere Proteine. Letztere liegen an der zytoplasmatischen Seite und sind für die Kopplung von ATP-Hydrolyse und Transportaktivität verantwortlich. Die beiden die Membran durchdringenden Untereinheiten enthalten jeweils sechs Transmembransegmente (Typ IV). Bei den eukaryotischen ABC-Proteinen (zum Beispiel P-Glykoprotein) sind die Untereinheiten miteinander verbunden, so daß das Protein aus vier Domänen besteht, wobei jeweils eine Kassette von sechs Transmembransegmenten durch einen großen hydrophilen und zytoplasmatischen loop mit der zweiten hydrophoben Kassette verbunden ist, an deren C-Terminus nochmals eine große hydrophile und zytoplasmatische Domäne lokalisiert ist.

Den ABC-Proteinen werden bisher mehr als fünfzig Proteine zugeordnet, so die P-Glykoproteine (kovalente Verbindung zweier Kassetten) oder die TAPs (transporters associated with antigen processing, TAP1 und TAP2), die einen Peptidtransport durch die Membran und damit eine Antigenpräsentation ermöglichen (nichtkovalente Bindung zweier Kassetten).

Weitere Kassettenproteine wie verschiedene Spannungs-abhängige Kationenkanäle ähneln den ABC-Proteinen. Der K-Kanal enthält einmal sechs, der Na-Kanal und die a1-Untereinheit des Dihydropyridin-sensitiven Ca-Kanals viermal sechs, Neurotransmitter-Transporter, Glucose-Transporter und die Adenylatcyclase zweimal sechs Membransegmente.

Literatur:

  1. Bean, B.P., Pharmacology and electrophysiology of ATP-activated ion channels. TiPS 13 (1992) 87-90.
  2. Yeagle, P.(Hrsg.), The Structure of Biological Membranes. CRC Press, Boca Raton 1992. a: S.374; b: S.380; c: S.349.
  3. Higgins, C., ABC transporters: from microorganisms to man. Annu. Rev. Cell Biol. 8 (1992) 67-113.
  4. Greenberger, L.M., Ishikawa, Y., ATP-Binding Cassette Proteins. Common Denominators Between Ion Channels, Transporters, and Enzymes. Trends Cardiovasc.Med. 4 (1994) 193-198.

Anschrift des Verfassers:
Professor Dr. Peter Nuhn,
Institut für Pharmazeutische Chemie,
Martin-Luther-Universität Halle Wittenberg,
Wolfgang-Langenbeck-Str. 4, 06120 Halle/Saale Top

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E-Mail: redaktion@govi.de

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