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Zentraler Mediator im Immunsystem und bei Entzündungen

11.01.1999  00:00 Uhr

-TitelGovi-Verlag

TRANSKRIPTIONSFAKTOR NF-kB

Zentraler Mediator im Immunsystem und bei Entzündungen

Um zu überleben, müssen alle Organismen schnell und effektiv auf Einflüsse ihrer Umgebung reagieren. Dazu zählen radioaktive und ultraviolette Strahlung, infektiöse Agentien wie Bakterien, Viren oder deren Zellprodukte sowie auch erhöhte Konzentrationen an Botenstoffen wie Zytokinen. Die Folge ist in vielen Fällen die Induktion der De-novo-Synthese spezieller Proteine, zum Beispiel der proinflammatorisch wirkenden Zytokine TNF-a und IL-1. Diese Zytokine lösen nun in Zellen, die das erste pathogene Signal nicht erhalten haben, die erneute Bildung inflammatorisch wirkender Verbindungen aus. Jetzt läuft die normale Immunantwort an (1 - 3). Transkriptionsfaktoren regulieren die Transkription der Gene für sehr viele Entzündungsmediatoren. Eine Schlüsselrolle im Immun- und Entzündungsgeschehen spielt der Transkriptionsfaktor NF-kB.

In diesem Artikel sollen zunächst Transkriptionsfaktoren allgemein und dann der Transkriptionsfaktor NF-kB behandelt werden. Ferner werden pharmazeutisch wichtige Substanzen vorgestellt, bei denen eine Beeinflussung dieses Transkriptionsfaktors nachgewiesen worden ist oder diskutiert wird.

Aufgaben und Einteilung der Transkriptionsfaktoren

Bei der Transkription wird die Nukleotidsequenz der DNA mit Hilfe der DNA-abhängigen RNA-Polymerasen (RNA-Pol) in die Nukleotidsequenz der RNA umgeschrieben. Die Transkription bei Eukaryonten unterscheidet sich in einigen Punkten von der, die in Prokaryonten nachgewiesen wurde. Während Prokaryonten nur eine RNA-Polymerase besitzen, enthalten eukaryontische Zellen verschiedene Formen (RNA-Pol I bis III), die für die Transkription unterschiedlicher Gengruppen verantwortlich sind. So werden Gene, die für Proteine codieren, mit Hilfe der RNA-Polymerase II (RNA-Pol II) transkribiert (4, 5).

Die eukaryontischen RNA-Polymerasen können die Transkription aber nicht selbst beginnen. Sie benötigen Proteine, Transkriptionsfaktoren, die zunächst an den Promotor binden und so die Polymerasen bei der Erkennung der richtigen Startstelle auf der DNA und beim Transkriptionsstart unterstützen. Im Gegensatz zur RNA-Pol I und RNA-Pol III können mit der RNA-Pol II sehr viele Transkriptionsfaktoren zusammenarbeiten. Bei den Transkriptionsfaktoren unterscheidet man je nach Aufgaben drei Typen:

  • Die allgemeinen Transkriptionsfaktoren (general factors), wie TFIID, sind an allen Promotoren zur Einleitung der RNA-Synthese notwendig. Sie legen die Initiationsstelle fest und bilden mit der RNA-Pol II den basalen Transkriptionsapparat. Außerdem sind sie für das lokale Öffnen der DNA-Doppelhelix und das Stabilisieren der Einzelstränge verantwortlich (promotor melting) und fördern die Freisetzung der RNA-Pol II aus dem Initiationskomplex (promotor clearance oder Elongation) (6, 7).
  • Die konstitutiven upstream-Faktoren sind DNA-bindende Proteine, die stromaufwärts (upstream) vom Startpunkt der Transkription binden. Diese ubiquitär vorkommenden Faktoren wirken auf jeden Promotor, dessen DNA die passende Bindungsstelle enthält, und erhöhen die Effizienz des Transkriptionsstartes. Jeder Promotor benötigt einen für ihn charakteristischen Satz dieser Faktoren, damit sein Gen zur vollen Expression gelangt.
  • Die induzierbaren Faktoren (inducible factors), wie AP-1 oder NF-kB, agieren ähnlich wie die upstream-Faktoren, besitzen aber zusätzlich regulatorische Funktionen. Ihre Synthese oder Aktivierung erfolgt zu bestimmten Zeiten oder Anlässen in bestimmten Geweben (5, 8).

Transkriptionsfaktoren besitzen eine DNA-Bindedomäne und eine Transaktivierungsdomäne. Es wird diskutiert, daß einige Faktoren nach Bindung an ihre DNA-Erkennungssequenz die dreidimensionale DNA-Struktur verändern können. Durch diesen als DNA-bending bezeichneten Prozeß kann die Transaktivierungsdomäne in den Bereich des basalen Transkriptionsapparates gelangen, wodurch es zu Wechselwirkungen kommen kann.

Die meisten Transkriptionsfaktoren, vor allem die induzierbaren, werden posttranslational durch Phosphorylierung, Ligandenbindung oder Assoziation mit regulatorischen Untereinheiten modifiziert. Diese Veränderungen können die subzelluläre Lokalisation, das DNA-Bindungsverhalten, das transkriptionsaktivierende Potential oder die Interaktion mit anderen Transkriptionsfaktoren beeinflussen (9).

In den vergangenen 10 bis 15 Jahren hat sich der Wissensstand auf dem Gebiet der Transkriptionsfaktoren geradezu dramatisch vergrößert. Mittlerweile sind sehr viele Faktoren kloniert und molekularbiologisch charakterisiert worden.

Transkriptionsfaktor NF-kB

Der Nuclear Factor kappa B (NF-kB) liegt im Cytoplasma der meisten Zellen als Homo- oder Heterodimer aus strukturähnlichen Proteinen vor, die zur NF-kB-Familie zusammengefaßt werden. Es handelt sich also um eine Gruppe von Transkriptionsfaktoren, die an eine spezifische DNA-Sequenz (Konsensus: 5’-GGGACTTTCC-3’) binden. Dieses Sequenzmotiv wurde erstmals im Enhancer des Immunglobulingens für die kL-(leichte) Kette von B-Lymphozyten gefunden (10, 11).

Jedes Protein dieser Familie besitzt an seinem N-Terminus eine etwa 300 Aminosäuren umfassende Homologiedomäne, die je nach Autor als Rel-Homologie-Domäne (RHD) (12) oder als NF-kB/Rel/dorsal-Domäne (NRD) (13) bezeichnet wird; hier liegen DNA-Bindedomäne, Dimerisierungsdomäne, Transaktivierungsdomäne und Translokationssequenz (NLS = nuclear localization signal). Bis heute sind fünf NF-kB-Proteine in Säugetierzellen identifiziert worden: p65 (RelA), c-Rel, RelB, p50/p105 und p52/p100. Die beiden letzten stellen Vorläuferproteine von 105 und 100 kDa dar, aus denen die kleineren Proteine p50 und p52 nach limitierter Proteolyse des C-Terminus entstehen (14, 15). Als NF-kB-Prototyp gilt ein Heterodimer mit einer p50- und p65-Untereinheit. Mit wenigen Ausnahmen können die aufgeführten NF-kB-Proteine in vivo in unterschiedlichen Kombinationen sowohl Heterodimere (wie p50-c-Rel, p65-c-Rel, p52-p65) als auch Homodimere (p50-p50 und p65-p65) bilden (16 - 19). Am stabilsten ist das p50/p65-Heterodimer (19, 20).

Unter den fünf NF-kB-Untereinheiten spielt p65 wegen seiner hohen transaktivierenden Potenz eine herausragende Rolle. p65 ist ein häufiger Bestandteil in induzierbaren Komplexen in Immunzellen und anderen Zellen. c-Rel- und RelB-Proteine haben eine vergleichbare transaktivierende Aktivität, scheinen aber mehr in Immunzellen vertreten zu sein. Die p50- und p52-Untereinheiten wirken gar nicht oder nur gering transaktivierend, bilden aber Heterodimere mit den anderen drei Untereinheiten, die eine hohe DNA-Binde-Affinität aufweisen (13, 21).

IkB-Proteine wirken inhibitorisch

Während NF-kB nur in den Kernen von einigen Immunzellen (wie B-Zellen) als konstitutiv aktives Heterodimer vorliegt (12), tritt es im Cytosol nicht stimulierter Zellen als inaktiver Komplex auf. Verantwortlich dafür sind inhibitorische Proteine der IkB-Familie wie IkB-a, -b und -e, Bcl-3, p100 und p105. Am auffälligsten ist eine allen gemeinsame repetitive Sequenz von 30 bis 33 Aminosäuren, die als Ankyrinregion bezeichnet wird. Sie interagiert mit den entsprechenden Bereichen der Rel-Homologiedomäne von NF-kB-Proteinen (14, 22), maskiert die Sequenz des Translokationssignals (NLS) von NF-kB und verhindert seine Translokation in den Zellkern (13, 14, 23). Die verschiedenen NF-kB-Komplexe weisen nicht nur eine gewisse Stimulus- und Zellspezifität auf, sondern interagieren auch in unterschiedlichem Maße mit verschiedenen IkB-Proteinen. Dies bedeutet, daß die kB-vermittelte Genexpression vom Zelltyp und von der Zusammensetzung des aktiven NF-kB-Dimers abhängt (12, 13, 22, 24).

Eine Sonderstellung innerhalb der IkB-Familie nehmen die bereits erwähnten Proteine p50/p105 und p52/p100 ein. Sie weisen neben der Ankyrinregion zusätzlich die RHD auf, wodurch diese Proteine eine Doppelfunktion besitzen. Sie sind nicht nur Vorläufermoleküle für die entsprechenden NF-kB-Proteine p50 und p52, sondern besitzen als Teil eines NF-kB-Dimers, in Analogie zu IkB-Proteinen, eine inhibitorische Funktion und können daher als intramolekulares IkB bezeichnet werden (12, 25).

Äußere und innere Induktoren

NF-kB induziert die Expression einer großen Anzahl von Genen, mit deren Aktivierung die Zelle auf Streß, Verletzungen und Entzündungen antwortet. Daher ist es nicht verwunderlich, daß NF-kB durch zahlreiche Signale aktiviert wird. Als potente Stimulantien gelten Zytokine wie IL-1 und TNF-a, bakterielle und virale Produkte wie Lipopolysaccharide, doppelsträngige RNA und das Tax-Protein des HTLV-1-Virus sowie auch pro-apoptotische und nekrotische Stimuli wie freie Sauerstoffradikale, UV-Licht und Gamma-Strahlen (16, 26, zusammenfassende Übersicht bei 21). Es ist aber wichtig festzuhalten, daß nicht jeder Stimulus jedes Zielgen in jedem Zelltyp aktiviert. Es existieren je nach Zelltyp spezifische Unterschiede. Häufig erfolgt die Genexpression erst im Zusammenspiel mit anderen Transkriptionsfaktoren oder entsprechende Gene werden nur durch bestimmte Stimuli aktiviert (21). So wird der Interferon-b-Genpromotor nur nach einer Virusinfektion aktiviert (27).

Wie wird NF-kBaktiviert?

Inaktives NF-kB im Cytoplasma der Zelle besteht aus NF-kB-Proteinen, die entweder mit IkB-a oder mit einem Vorläufermolekül, p100 oder p105, assoziiert sind (14). Die Aktivierung von NF-kB läuft folgendermaßen ab: Nach zellulärer Stimulierung kommt es zunächst zur Phosphorylierung von IkB-a an den Serinresten 32 und 36 oder der beiden Vorläufermoleküle (28, 29). Dies ist das Signal für die Ubiquitinierung der inhibitorischen Untereinheiten, die damit für den proteolytischen Abbau durch das 26S-Proteasom markiert werden (30). IkB-a wird komplett abgebaut, während eine Glycin-reiche Region bei den Vorläufermolekülen p100 und p105 dafür sorgt, daß nur der C-terminale Bereich degradiert wird (15).

Die Aktivierung der NF-kB-Vorläufermolekül-Komplexe dauert länger als die der IkB-haltigen Komplexe. Die p100- und p105-haltigen Komplexe repräsentieren daher eher "latente" Quellen für induzierbares NF-kB. IkB-haltige Komplexe sind "aktiver" und können eine schnellere Antwort auf einen Stimulus vermitteln (14). Funktionell aktives NF-kB wandert schließlich in den Zellkern, um dort kB-abhängige Transkriptionsvorgänge zu steuern.

Regulierung der Aktivität

Interessanterweise kann NF-kB seine eigene Transkription regulieren und steigern. Die Transkriptionsrate der Gene für die Proteine c-Rel, Rel B und p105, nicht aber die von p65, wird deutlich erhöht, wenn aktives NF-kB im Zellkern vorliegt (31). Es konnte gezeigt werden, daß sich in den Promotoren dieser Gene NF-kB-Bindestellen befinden (32 - 34).

Das gleiche gilt für das IkB-a-Gen (35). Bei der NF-kB-Aktivierung werden zunächst die inhibitorische Untereinheit IkB-a oder die inhibitorisch wirksamen Teilabschnitte von p100 und p105 abgebaut. Mit zeitlicher Verzögerung setzt jedoch die kB-abhängige Neusynthese von IkB-a ein, das in den Zellkern wandert, aktives NF-kB von der DNA löst und in das Cytoplasma zurücktransportiert (36). Neben dieser negativen Feed-back-Hemmung, die ein Überschießen der Reaktionen verhindert, führt die NF-kB/IkB-Reakkumulation ebenso wie die kB-abhängige Transkription von NF-kB-Proteinen zur Bildung induzierbarer Komplexe, die nach erneuter Stimulierung aktiviert werden können. c-Rel-haltige Dimere sind übrigens weniger anfällig für den nachträglichen Angriff durch IkB-a. Zudem beeinflussen sie die IkB-a-Neusynthese negativ (13); daher können sie einen Stimulus-vermittelten Effekt länger aufrechterhalten als andere Dimere.

Phosphorylierung von IkB als Schlüsselreaktion

Letztendlich führen alle Stimuli über spezifische Rezeptoren auf unterschiedlichen Signaltransduktionswegen über die Aktivierung der IkB-Kinasen zur Phosphorylierung von IkB-a. Diese Phosphorylierung nimmt eine Schlüsselposition bei der NF-kB-Aktivierung ein (28, 37). Es wurden einige Kinasen entdeckt, die IkB phosphorylieren konnten (38, 39), denen aber letztendlich die notwendige Spezifität fehlte. Kürzlich konnte nachgewiesen werden, daß TNF und IL-1 die Kinase NIK (NF-kB-induzierende Kinase) aktivieren (40). NIK bildet mit zwei weiteren Kinasen, IKK-a und IKK-ß, einen besonderen IKK-Kinase-Komplex (41 - 44), der bevorzugt an NF-kB gebundenes IkB-a phosphoryliert; frei vorliegendes IkB wird nicht so schnell angegriffen und kann durch Bindung an NF-kB dessen Aktivierung beenden (45).

Auch dieser Aspekt trägt zur Autoregulation der NF-kB-Aktivität bei. Inwieweit die IKKs in ihrer Aktivität beispielsweise durch andere Kinasen oder Phosphatasen reguliert werden, ist bisher nicht geklärt und Gegenstand zahlreicher Untersuchungen.

H2O2 als Second-messenger

Viele NF-kB-Stimuli führen zur Bildung reaktiver Sauerstoffintermediate, vor allem H2O2. H2O2 gilt nach Meinung einiger Autoren als universeller Second-messenger auf dem Signaltransduktionsweg der NF-kB-Aktivierung (13, 46 - 48). Unterstützt wird diese Hypothese dadurch, daß strukturell unterschiedliche Antioxidantien wie Dithiocarbamat (49) oder Vitamin E (50) NF-kB hemmen, und daß das direkte Einwirken von H2O2 in einigen Zellen eine NF-kB-Aktivierung auslöst (46), die durch Katalase-Aktivität aufgehoben wird (51). Dieser direkte H2O2-Einfluß konnte in anderen Zellen, die durch TNF-a oder IL-1 stimuliert wurden, jedoch nicht beobachtet werden (52). Auch die Rolle von Antioxidantien wird kontrovers diskutiert. Einerseits hemmen viele Antioxidantien die NF-kB-Aktivierung (53), andererseits waren manche Induktoren trotz deren Gegenwart aktiv (54). Ferner wurde beobachtet, daß die Bindung von aktiviertem NF-kB an seine DNA-Erkennungssequenz, vermittelt durch einen redoxsensitiven Cystein-Rest (Cys 62) von p50, reduzierende Bedingungen erfordert (55 - 57).

NF-kB als zentraler Mediator im Immunsystem

NF-kB ist ein zentraler Mediator im Immunsystem. Das Protein beeinflußt die Transkription einer Vielzahl von Genen, die im Entzündungsgeschehen involviert sind (21, 58). Das gezielte Ausschalten von NF-kB/IkB-Genen in gentechnisch veränderten Mäusen führt zu Fehlentwicklungen und Funktionsstörungen im Immunsystem (59). Null-Mutanten von p65 sterben im Uterus und weisen massive Apoptose in der Leber auf. Das Ausschalten des p50-Gens führt zu mangelhafter B-Lymphozytenfunktion.

Eine wichtige Rolle als Entzündungsmediatoren spielen Zytokine. Aktivierte Zellen im entzündeten Gewebe produzieren Zytokine wie IL-8, um andere Immunzellen an den Ort der Entzündung zu locken. Unterstützt werden sie dabei von Leukotrienen, die als Folge der kB-abhängigen Phospholipase-Expression gebildet werden (60). Ein weiteres zentrales, kB-gesteuertes Enzym im Entzündungsgeschehen ist die Cyclooxygenase 2 (COX 2) (61), die die Bildung von Prostaglandinen katalysiert. Diese erweitern die Blutgefäße ebenso wie Stickstoffmonoxid, das im Zuge der kB-abhängigen Aktivierung der induzierbaren NO-Synthase produziert wird (62). Durch die erhöhte Durchblutung werden vermehrt Lymphozyten, Granulozyten, Monozyten und Makrophagen in das entzündete Gewebe transportiert. Die Endothelzellen der dort verlaufenden Blutgefäße produzieren, ebenfalls NF-kB gesteuert, auf ihrer Oberfläche Adhäsionsmoleküle (63 - 66). Diese ermöglichen die Adhäsion an das Gefäßendothel und induzieren die transendotheliale Wanderung der Leukozyten. Die weitere Zytokinausschüttung unterhält proinflammatorische Stoffwechselprozesse wie die vermehrte Bildung von reaktiven Sauerstoffderivaten ("oxidative burst") (67). Die gebildeten Mediatoren verstärken die Entzündungsreaktionen aber auch durch eine positive Rückkopplung auf die Aktivierung des Transkriptionsfaktors. Die gezielte Beeinflussung seiner Aktivität bietet somit einen interessanten Ansatz in der Therapie akuter und chronischer Entzündungen.

NF-kB und Arzneimittel

Im Laufe der letzten Jahre wurden viele Substanzen bezüglich ihrer Wirkung auf den Transkriptionsfaktor NF-kB untersucht. Darunter befinden sich auch Arzneistoffe, die schon lange eingesetzt werden, deren Wirkungen aber bisher nicht vollständig erklärt werden konnten.

Acetylsalicylsäure und Natriumsalicylat

Salicylate hemmen die Expression der Phospholipase A2 und der endothelialen Leukozyten-Adhäsionsmoleküle über die Hemmung von NF-kB.

Die Wirkung der Acetylsalicylsäure (ASS) wird bekanntlich auf eine Hemmung der Cyclooxygenase durch irreversible Acetylierung zurückgeführt (68). Natriumsalicylat kann wegen fehlender Acetylgruppe nicht auf diese Weise agieren, hemmt das Enzym aber dennoch in höheren Konzentrationen (ED50 254 mmol/l, ASS 1,76 mmol/l) (69). Natriumsalicylat muß daher zusätzlich an anderer Stelle in den Entzündungsprozeß eingreifen.

Einen Erklärungsansatz lieferten Kopp und Ghosh, als sie sowohl für ASS als auch für Natriumsalicylat einen hemmenden Effekt auf den Transkriptionsfaktor NF-kB feststellten (70). Allerdings waren in diesem Testsystem relativ hohe Konzentrationen (20 mM) zur vollständigen Hemmung nötig. Die Autoren argumentieren, daß diese hohen Konzentrationen im Plasma von Patienten erreicht werden, die wegen chronisch-entzündlicher Zustände wie Arthritis mit Salicylaten behandelt werden. Außerdem soll der pH-Wert im entzündeten Gewebe die Aufnahme dieser Arzneistoffe begünstigen und so zu hohen lokalen Wirkspiegeln führen. Trotzdem bleibt die Frage nach der therapeutischen Relevanz.

In weiteren Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß ASS durch Hemmung von NF-kB die Expression der Interleukin-1b-induzierbaren Phospholipase A2 unterdrücken kann (60). Durch Hemmung dieses zentralen Enzyms der Arachidonsäure-Kaskade werden weniger von den wichtigsten Entzündungsmediatoren wie Prostaglandine, Leukotriene und PAF (Plättchen-aktivierender-Faktor) gebildet. Jedoch reichten auch bei diesen Experimenten pharmakologische Konzentrationen von ASS nicht aus, um die Expression der Phospholipase A2 komplett zu unterdrücken. Salicylate blockieren ferner die Expression von endothelialen Leukozyten-Adhäsionsmolekülen sowie die Transmigration von Neutrophilen (71).

Über den Mechanismus der Hemmung von NF-kB durch Salicylate gibt es konkrete Vorstellungen. Die Salicylate sollen die Phosphorylierung der inhibitorischen Untereinheit IkB-a und damit deren Degradation verhindern (70, 71). Dadurch wird NF-kB im inaktiven Zustand im Cytosol zurückgehalten und kann nicht in den Zellkern wandern: Die Expression der Entzündungsgene unterbleibt. Für die Hemmung der Phosphorylierung werden verschiedene Möglichkeiten diskutiert. Der IkB-a-Kinase-Komplex könnte gehemmt oder Phosphatasen aktiviert werden (71).

Weiterhin ist möglich, daß Salicylate als Radikalfänger wirken und reaktive Sauerstoffintermediate abfangen, die während der NF-kB-Aktivierung entstehen und den IkB-Kinase-Komplex aktivieren (71). Zum besseren Verständnis der Radikalfänger-Eigenschaften ist die Kenntnis des Metabolismus der Salicylate wichtig. ASS wird in aktivierten polymorphonuklearen Leukozyten zuerst zu Salicylsäure deacetyliert und dann zu 2,3-Dihydroxybenzoesäure, 2,5-Dihydroxybenzoesäure (Gentisinsäure) und 2,3,5-Trihydroxybenzoesäure hydroxyliert. Diese Verbindungen können durch Sauerstoffradikale zu Chinonen oxidiert werden (72). Auch beim Metabolismus von ASS in der menschlichen Leber entsteht unter anderem 2,5-Dihydroxybenzoesäure (67). Auf diese Weise könnten Salicylate auch aufgrund ihrer antioxidativen Eigenschaften NF-kB hemmen.

Untersuchung von Antiphlogistika

Auf der Suche nach einem Standard für unsere eigenen Versuche mit NF-kB stießen auch wir auf ASS. ASS hemmt im Electrophoretic Mobility Shift Assay bei einer 20 millimolaren Konzentration vollständig die Freisetzung von NF-kB in Jurkat-T-Zellen, Zellen aus einem humanen T-Zell-Lymphom.

Diese Zellen werden für eine Stunde bei 37 °C mit der zu testenden Substanz vorinkubiert und anschließend mit TNF-a stimuliert. Nun setzt die beschriebene Aktivierungskaskade ein. Nach einer Stunde wird dieser Prozeß unterbrochen, und es werden Gesamtproteinextrakte aus den Zellen hergestellt. In diesen Extrakten befindet sich nun das freie, aktive NF-kB. Eine bestimmte Menge Proteinextrakt wird nun mit einem 32P-radioaktiv markierten Oligonukleotid versetzt, das die spezifische NF-kB-Bindesequenz besitzt. Das freie NF-kB bindet an das markierte Oligonukleotid. Anschließend wird dieser Ansatz elektrophoretisch im Polyacrylamid-Gel aufgetrennt. Das Gel wird getrocknet und auf einen Röntgenfilm gelegt. Die radioaktive Strahlung schwärzt den Film an den Stellen, an denen sich markiertes Oligonukleotid befindet.

In den Extrakten von unstimulierten Zellen liegt fast kein freies NF-kB vor. In stimulierten Zellen wurde NF-kB in großer Menge freigesetzt. In weiteren Versuchen wurde mit steigenden Konzentrationen ASS vorinkubiert. 10 mM ASS  haben einen stark hemmenden Effekt, 20 mM verhindern die Aktivierung von NF-kB komplett.

Wir gingen weiter der Frage nach, ob auch andere nichtsteroidale Antiphlogistika (NSAIDs) oder Basis-Antirheumatika über eine Beeinflussung von NF-kB wirken. Daher testeten wir weitere acht Vertreter aus unterschiedlichen Substanzklassen: aus der Gruppe der Essigsäurederivate Diclofenac, von den Propionsäurederivaten Ibuprofen, von den Oxicamen Piroxicam, von den Anthranilsäurederivaten Mefenaminsäure sowie Azapropazon und Bufexamac. Einbezogen wurden auch die Basistherapeutika Chloroquindiphosphat und Methotrexat. Keine Substanz hemmte in 1 millimolarer Konzentration NF-kB vollständig. Höhere Konzentrationen wurden nicht getestet. In einem anderen Versuch zeigte auch Indometacin bis zu einer Konzentration von 500 mM keine Hemmung.

Der primäre Angriffspunkt dieser Antiphlogistika scheint nicht der Transkriptionsfaktor NF-kB zu sein. Die antiphlogistische Wirkung beruht, zumindest bei den meisten NSAIDs, auf der Beeinflussung der Enzyme des Arachidonsäurestoffwechsels (67). Eine Ausnahme verdient Beachtung: Tepoxalin, ein dualer Inhibitor der Cyclooxygenase und 5-Lipoxygenase, hemmt NF-kB bereits in einer 20 mikromolaren Konzentration, indem er die Degradierung von IkB blockiert (75).

Goldverbindungen

Zu den Basistherapeutika gehören auch Goldverbindungen wie Aureothioglucose, Natriumaurothiomalat oder Auranofin, die bei chronisch-entzündlichen Rheumaformen, besonders bei der rheumatoiden Arthritis eingesetzt werden. Bisher wurde diskutiert, daß Goldverbindungen die Bildung endothelialer Adhäsionsmoleküle hemmen. Dies und die Tatsache, daß der Interleukin-1-Spiegel während der Therapie abnimmt (67), deutet auf einen Zusammenhang mit NF-kB hin. 1995 wies eine japanische Arbeitsgruppe nach, daß die drei Verbindungen, die einwertiges Gold enthalten, sowie eine weitere mit dreiwertigem Gold, konzentrationsabhängig die Bindung von NF-kB an die DNA hemmen (76). Aureothioglucose war mit einer Hemmkonzentration von weniger als 100 mM am besten, Auranofin am schlechtesten wirksam. Dies führen die Autoren auf die geringere Löslichkeit von Auranofin in Wasser zurück. Die Inhibition soll dadurch zustande kommen, daß die Goldverbindungen Thiol-Gruppen von NF-kB zu Disulfiden oxidieren. Die Goldionen werden zu elementarem Gold reduziert.

Corticosteroide

Obwohl Glucocorticoide schon seit Jahrzehnten aufgrund ihrer antiinflammatorischen und immunsuppressiven Wirkung eingesetzt werden, herrscht bis heute keine endgültige Klarheit über ihren Wirkmechanismus. Die Eingriffe in das Entzündungsgeschehen sind vielfältig und betreffen auch den Transkriptionsfaktor. 1995 wies Scheinman nach, daß Dexamethason NF-kB funktionell hemmt und die NF-kB-abhängige Genexpression unterdrückt (77). Im selben Jahr gelang der Nachweis, daß Dexamethason die Transkription des IkB-a-Gens induziert und dadurch die Synthese des IkB-a-Proteins steigert (78). Frisch synthetisiertes IkB-a kann mit gerade freigesetztem NF-kB schnell reassoziieren und damit dessen Wanderung in den Zellkern und die Aktivierung der Transkription der Zielgene verhindern. Es kann außerdem selbst in den Kern wandern und bereits gebundenes NF-kB von der DNA ablösen.

Diese Abläufe werden über den Glucocorticoid-Rezeptor-Komplex (GRK) vermittelt. Nach Penetration in die Zelle bindet das Glucocorticoid an den Glucocorticoid-Rezeptor, Hitze-Schock-Proteine werden abgespalten und der GRK wandert in den Nukleus. Dort gibt es mehrere Möglichkeiten (79). Der GRK bindet an NF-kB und unterdrückt dessen Aktivität, indem er dessen Bindung an die DNA verhindert. Er kann aber auch NF-kB in der DNA-gebundenen Form angreifen und seinen transkriptionsaktivierenden Effekt hemmen. Die dritte Möglichkeit besteht in der Induktion der Transkription des IkB-a-Gens und der damit verbundenen Neusynthese des Inhibitors. Nach neueren Untersuchungen scheint die Bedeutung der Neusynthese von IkB-a für den pharmakologischen Effekt wieder fragwürdig (80).

Antioxidantien

Viele Antioxidantien sollen die Aktivierung von NF-kB unterdrücken, indem sie die reaktiven Sauerstoffintermediate abfangen. Experimentell wird sehr häufig PDTC (Pyrrolidin-Dithiocarbamat) verwendet (66, 53). Pharmazeutisch interessanter sind Substanzen, die bereits therapeutisch verwendet werden, wie die Vitamin-E-Derivate a-Tocopherolacetat oder a-Tocopherolsuccinat. Auch a-Liponsäure, die bei diabetischer Polyneuropathie eingesetzt wird, hemmt die Aktivierung des Transkriptionsfaktors ebenso wie das Expektorans N-Acetylcystein (NAC) (81). Der Hauptwirkstoff verschiedener Capsicum-Arten, Capsaicin, der lokal aufgrund seiner antiphlogistischen Aktivität verwendet wird, verhindert ebenfalls die Aktivierung von NF-kB (82). Da die Expression der Cyclooxygenase 2 von NF-kB kontrolliert wird (58, 61), hemmt Capsaicin letztlich die Synthese von Prostaglandinen (83). Ob hier tatsächlich ein antioxidativer Mechanismus zugrunde liegt, ist aber noch nicht abschließend geklärt.

Dasselbe gilt für Curcumin, einen der Hauptinhaltsstoffe verschiedener Curcuma-Arten. Für Curcumin sind neben cholagogen auch entzündungshemmende Eigenschaften nachgewiesen worden (84). Curcumin soll die NF-kB-Aktivierung entweder wegen seiner antioxidativen Eigenschaften oder durch Hemmung von Proteinkinasen unterdrücken (85). Aus Propolis, dem Kittharz der Honigbiene, können Kaffeesäurephenylester isoliert werden. Kaffeesäurephenylester und verschiedene Derivate hemmen konzentrationsabhängig die NF-kB-Aktivierung; es wird auch hier ein antioxidativer Wirkmechanismus diskutiert (86).

Sesquiterpenlactone

Mit den Sesquiterpenlactonen (SLs) beschäftigen wir uns zur Zeit schwerpunktmäßig in unserer Arbeitsgruppe. Wir isolieren aus volksmedizinisch verwendeten Pflanzen Sesquiterpenlactone und untersuchen diese auf ihre antiinflammatorische Aktivität, wobei der Transkriptionsfaktor NF-kB als Target im Mittelpunkt steht.

Viele Zubereitungen, die SLs enthalten, werden aufgrund ihrer entzündungshemmenden Eigenschaften eingesetzt, zum Beispiel die aus Arnicae flos bereitete Arnikatinktur. Als Hauptwirkstoffe werden Helenalin, 11a,13-Dihydrohelenalin, Chamissonolid und deren Esterderivate angesehen (87). Trotz zahlreicher Ergebnisse zur antiinflammatorischen Aktivität fehlte bisher ein schlüssiger molekularer Mechanismus, der diese zufriedenstellend erklären konnte. Kürzlich konnten wir nachweisen, daß Helenalin schon in sehr niedrigen Konzentrationen von 10 mM die Aktivierung von NF-kB komplett hemmt (74). Diese geringen Konzentrationen könnten nach percutaner Resorption im entzündeten Gebiet erreicht werden. In weitergehenden Untersuchungen konnten wir zeigen, daß die p65-Untereinheit von NF-kB direkt angegriffen wird (88). Dieser Angriff erfolgt höchstwahrscheinlich nach Art einer Michael-Addition über Sulfhydrylgruppen von bestimmten Cysteinen in der p65-Untereinheit, wodurch NF-kB nicht mehr an die DNA binden kann.

Auch andere Sesquiterpenlactone dürften ähnlich wirken. Dies zeigen unsere Untersuchungen mit Sesquiterpenlactonen aus Tithonia diversifolia, deren Zubereitungen in Mittelamerika bei Wunden und Hämatomen eingesetzt werden. Die untersuchten Stoffe hemmten allerdings NF-kB erst in Konzentrationen von 50 oder 200 mM (89).

Diverse Hemmstoffe von NF-kB

Der zur Ordnung der Eurotiales gehörende Schimmelpilz Aspergillus fumigatus produziert den sekundären Metaboliten Gliotoxin. Das Epipolythiodioxopiperazin wirkt stark immunsuppressiv und ist wahrscheinlich ein Grund für die Pathogenität von Aspergillus. Dieser Effekt auf die Zellen des Immunsystems scheint hauptsächlich auf einer Hemmung der NF-kB-Aktivierung zu beruhen (90). Ein weiterer Pilz-Metabolit ist Cyclosporin A. Dieses cyclische Oligopeptid aus elf Aminosäuren wird im Gegensatz zu Gliotoxin in der Therapie als Immunsuppressivum, zum Beispiel nach Transplantationen, eingesetzt. Effekte auf andere Transkriptionsfaktoren scheinen für seinen Wirkmechanismus aber bedeutsamer zu sein als die Hemmung von NF-kB (91).

Zusammenfassung

Der Transkriptionsfaktor NF-kB spielt eine Schlüsselrolle im Entzündungsgeschehen und im Immunsystem. Daß weit verbreitete Pharmaka wie Salicylate und Glucocorticoide ihre Wirkungen zumindest teilweise über Wechselwirkungen mit diesem Protein entfalten, unterstreicht seine Bedeutung. NF-kB wird in den nächsten Jahren die Entwicklung von antiinflammatorischen und immunsuppressiven Substanzen beeinflussen. Ein unspezifisches, komplettes Ausschalten von NF-kB über längere Zeit ist jedoch nicht sinnvoll, da dies zu Funktionsstörungen und Fehlentwicklungen führen könnte. Dennoch wird die gezielte Beeinflussung der Expression bestimmter Gene von Entzündungsmediatoren durch Pharmaka völlig neue therapeutische Möglichkeiten eröffnen.

PZ-Titelbeitrag von Peter Rüngeler, Guido Lyß und Irmgard Merfort, Freiburg

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Danksagung: Professor Dr. Heike L. Pahl, Institut für Experimentelle Anästhesiologie, Universitätsklinikum Freiburg, danken wir sehr herzlich für die kritische Durchsicht des Manuskripts.

Manuskript eingereicht am 26. Oktober 1998; angenommen am 6. November 1998.

Für die Verfasser:
Professor Dr. Irmgard Merfort
Institut für Pharmazeutische Biologie
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
Schänzlestraße 1,
79104 Freiburg
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