Identitätsprüfungen von Ausgangsstoffen |
 | 13.12.2011 15:41 Uhr |
ZL / Durch die Harmonisierung der Arzneibücher aus den USA, Japan und Europa sind mittlerweile zahlreiche Monographien im Europäischen Arzneibuch (Ph. Eur.) enthalten, die nur noch instrumentelle, auf die Industrie ausgerichtete Identifizierungsverfahren beinhalten und im Apothekenlabor nicht mehr ohne Weiteres durchgeführt werden können.
So wird beispielsweise inzwischen die Infrarotspektroskopie (IR) als unumgängliche Methode zum Identitätsnachweis in den Arzneibuchmonographien vieler Stoffe beschrieben. Den wenigsten Apotheken steht jedoch ein solches Gerät zur Verfügung. Allerdings entbindet die fehlende instrumentelle Ausstattung nicht von der Pflicht, die Identität des bestellten Stoffes – in Ergänzung zum Prüfzertifikat des Herstellers – beim Wareneingang nachzuweisen beziehungsweise auf mögliche Verwechslungen beim Abfüllen oder Etikettieren zu prüfen.
Einen Ausweg bietet oft der dritte Band des DAC »Alternativ-Verfahren zur Identifizierung von Ausgangsstoffen« mit einfacheren Vorschriften zum Beispiel zur Bestimmung der Schmelztemperatur (siehe dazu Identitätsprüfung von Ausgangsstoffen: Bestimmung der Schmelztemperatur, PZ 49/2011) und zur Dünnschichtchromatographie (DC). Es müssen jeweils alle für einen Stoff genannten Prüfungen durchgeführt werden. Die DC ist eine schnelle Methode, mit der unter geringem Substanzverbrauch und relativ kleinem apparativen Aufwand die Reinheit eines Stoffes überprüft beziehungsweise die Identität eines Stoffes durch Vergleich mit einer Referenzsubstanz gezeigt werden kann.
Hintergründe
Bei der DC handelt es sich um ein physikalisch-chemisches Trennverfahren, das auf Transportprozessen durch eine mobile flüssige Phase entlang einer stationären festen Phase beruht. Gelöste Moleküle werden je nach ihren chemischen Eigenschaften, der Polarität des Fließmittels und entstehenden Wechselwirkungen mit der Platte unterschiedlich gut beziehungsweise schnell transportiert, was zur Auftrennung eines Stoffgemisches führt.
Die übliche Vorgehensweise für die Dünnschichtchromatographie ist die Ph. Eur. Methode 2.2.27. Die stationäre Phase besteht aus einem geeigneten Material, das in dünner Schicht auf einer Trägerplatte, zum Beispiel aus Glas oder Kunststoff aufgetragen ist. Es ist sehr wichtig, dass bei der Prüfung in der Apotheke die richtige, vorgegebene Platte verwendet wird. Sehr häufig werden polare Kieselgel-Platten (Ph. Eur. Kieselgel R) eingesetzt, zum Teil in leicht veränderter Form wie mit Gips-Zusatz (Ph. Eur. Kieselgel G R) oder mit einem Fluoreszenzindikator (Ph. Eur. Kieselgel F254 R). Der Name der Platte beinhaltet meist eine Angabe zum Porendurchmesser (zum Beispiel Kieselgel 60).
Kapillare und Mikrospritze: Auftragen der Probelösung auf die DC-Platte mit verschiedenen Hilfsmitteln
Chromatographiekammern müssen aus einem inerten, durchsichtigen Material (in der Regel Glas) bestehen und einen flachen Boden sowie einen dicht schließenden Deckel haben. Vor der Prüfung wird das zu verwendende Fließmittel nach Vorschrift hergestellt und eine ausreichende Menge in die mit Filterpapier ausgekleidete Kammer gegeben. Häufig wird eine Mischung aus unpolaren bis mäßig polaren Lösungsmitteln verwendet (zum Beispiel Petrolether und Essigsäureethylester). Es empfiehlt sich, das Fließmittel immer frisch herzustellen, da häufig leicht flüchtige Lösungsmittel enthalten sind und sich die Zusammensetzung durch Verdunsten schnell verändert. Ganz entscheidend für eine ordentliche »Entwicklung« des Chromatogramms ist außerdem eine Kammersättigung durch Fließmitteldämpfe vor dem Start. Das Ph. Eur. gibt vor, dass die Kammer nach der Befüllung mit der mobilen Phase eine Stunde bei Raumtemperatur stehen soll.
Sorgfalt ist auch beim Auftragen der Probelösung gefragt. Es wird das vorgeschriebene Volumen mithilfe einer Kapillare oder Mikrospritze durch mehrmaliges Auftupfen punktförmig als zwei bis fünf Millimeter großer Fleck auf einer Linie, die parallel zur Unterkante der Platte verläuft, aufgetragen. Zwischen zwei Flecken sollte ein Abstand von mindestens einem Zentimeter und außerdem ein ausreichender Abstand zum Rand der Platte eingehalten werden. Um während dem Auftragen der Probelösungen eine schnellere Trocknung zu erreichen, kann mit einem Fön (kalte Luft) gearbeitet werden.
DC-UV-Licht: Chromatogramm eines Pflanzenextrakts und Referenzsubstanzen bei Betrachtung im UV-Licht.
Fotos: ZL
Nun wird die Platte in die Kammer eingestellt, wobei die Auftragslinie niemals in das Fließmittel eintauchen darf. Wenn das Fließmittel die vorgeschriebene Laufhöhe erreicht hat, kann die DC aus der Kammer entnommen und getrocknet werden. Die Detektion der Substanzflecken erfolgt meist unter UV-Licht bei 254 oder 365 nm. Manchmal müssen vor der Auswertung der Platte noch Reagenzien zum Derivatisieren aufgesprüht werden (Abzug!).
Bei Platten, die einen Fluoreszenzindikator enthalten, sind die aufgetrennten Stoffe als dunkle Flecken zu erkennen (Fluoreszenzlöschung). Als Referenzsubstanz zum Vergleich kann laut DAC »eine sämtlichen Anforderungen des Arzneibuches entsprechende Substanz, Zubereitung oder Droge mit anderer Chargenbezeichnung oder eine zertifizierte Referenz« verwendet werden. Neben dem Vergleich mit einer zusätzlich aufgetragenen Standardlösung besteht außerdem die Möglichkeit, die Substanz über ihren RF-Wert (Quotient aus der Laufstrecke der Substanz und der Laufstrecke des Fließmittels) unter Nutzung der Angaben in der Literatur zu identifizieren. /
